Western blot实验步骤 （1）将玻璃板刷洗干净，用双蒸水冲净，凉干。配10%过硫酸铵（最好先用现配）。在凝胶架上安装玻璃板，带有凹槽的向里。加入少量的去离子水，看是否漏水。如漏，则重新安装；不漏，则开始配胶。 （2）配分离胶胶、灌胶、水封面。 配12％的分离胶：凝胶储存液2 ml，分离胶缓冲液1.25 ml，双蒸水1.75 ml，10％APS 25μl，TEMED 2.5μl。轻轻振荡溶液使混匀（过量气泡会影响胶聚合）。用1000μl枪注胶。如分离胶液面不平，用手振荡一下凝胶架,振平胶面[19]。然后用200μl枪在胶上面加去离子水封面（沿玻璃板横着遛着加，避免水冲面），可加至水满这样可将胶表层小气泡赶出。待分离胶凝固后（约15分钟会再次重现折光面，再过5分钟等胶充分凝固）倾去水并用滤纸吸干。 （3）配5％的浓缩胶：凝胶储存液0.575 ml，浓缩胶缓冲液0.1675 ml，双蒸水0.25 ml，10％APS 7.5μl，TEMED 1.25μl。配置浓缩胶，用1000μl枪将其缓慢加入到分离胶上面，然后插上梳子，要避免气泡（插梳子时，可将梳子稍倾斜）。浓缩胶凝固后，样品中用加入上样缓冲液，在沸水浴中煮5-7 min取出，放于冰上冷却至少5 min。之后10 000 g离心10 min除去不溶杂质。玻璃板转移至电泳槽中，加少许缓冲液检查是否漏。如漏，卸下重新安装；不漏，慢慢加电泳缓冲液至加满内槽。垂直拔出梳子。然后用20μl枪将样品逐一加入，取15μl样品上样。完毕后续加电泳缓冲液，液面要低于分离胶面2 cm，并把内槽中补满液体（电泳缓冲液应在冰箱中提前放置一段时间预冷）。然后装上电泳仪，将电压量程调为600 V。先于80 V电压下电泳11 min左右，待样品压成一条线并即将进入分离胶时，切换至120 V电压。当溴酚蓝刚跑出分离胶时，切断电流。电泳大约需要80分钟。 （4）先将转印槽、剪刀、镊子等在ddH2O中浸泡一下，倒掉。再倒进电转缓冲液（4℃处理），同时按照胶的大小剪好滤纸及NC膜。剪好后将滤纸放入电转液中浸泡10－15分钟。取下凝胶，将需染色的一部分切下备用，另外一部分切去不用泳道及浓缩胶、加样孔，按照加样顺序在胶的左上方剪一小角，也放入电转液中静置10－15 min。一定要记清加样顺序与胶正反面的关系。泡好后按照（红）阳极－海绵－两层滤纸－膜－胶－两层滤纸－海绵－阴（黑）极的顺序放入转印槽中。每放好一层要赶一次气泡，直到最后放好海绵后用圆管再赶一次气泡。然后将转印槽放入电转仪中（注意要保证转印槽阴极与电转仪的阴极相对应），并放入冰盒。将电泳仪电压调至30V，4℃转膜15 h。 将取下的另一块凝胶放入培养皿中，加染色液将凝胶完全覆盖， 室温下振荡30 min，倾出染色液（可重复使用）。加入新的脱色液，振荡脱色至蛋白质条带清晰可见，并观察带型。期间可更换脱色液。 （5）转膜完成后拔下电源，取出转印槽。在一个干净的培养皿中加入适量的PBST。用镊子将膜取出并在膜与凝胶缺口对应的同一部位也剪一个三角缺口。再将膜朝着凝胶的一面向下放入PBST中洗5分钟。然后取出放入封闭液中（也是贴着凝胶的面向下，下同），室温振荡，2 h。 （6）一抗反应：将封闭好的膜取出用PBST振荡洗3次，每次5 min。以5%的封闭液来稀释一抗，剪一张比尼仑膜略大的塑料膜（注意不要用手接触塑料膜内部），将NC膜放入其中，用注射器吸取抗体液加入塑料膜中，赶尽气泡后以封口机封口。放入室温静置3h； （7） 二抗反应：将一抗孵育过的膜从冰箱中取出，在PBST中洗三次，每次5 min。以5%的封闭液来稀释二抗。剪略大于NC膜的塑料膜，放入尼仑膜后封口。加入二抗溶液，赶尽气泡后再封好口。室温静置2 h。 （8）拿出膜，在PBST中洗4次，每次5 min。配置DAB显色液，取4ml小管用锡箔纸包裹，加入1mlHRP buffer、50μl试剂A、50μl试剂B、50μl试剂C后混匀。避光染色。出现明显信号后，倾掉显色液。PBS浸洗终止。 （9）扫描膜，保存结果。