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    文献综述-蛋白含量测定方法

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    文献综述
    蛋白质含量的测定方法

    摘要食品中蛋白质是人体中最重要的营养要素之一，测定蛋白质的含量是食品检验工作中很重要的一项内容。本文主要对现阶段食品中蛋白质含量测定的常用方法进行探讨，介绍这些方法的原理、实验步骤、特点及应用等方面的内容。关键词：蛋白质含量测定方法原理特点应用
    1蛋白含量的测定方法1.1凯氏定氮法
    凯氏定氮法是测定蛋白质的经典方法，也是我国规定的测定食品中蛋白质含量的标准方法。1.1.1实验原理
    蛋白质是含氮的有机化合物。含蛋白质样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中的碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后取消化液碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，计算出蛋白质含量。计算公式如下，
    含氮量×6.25=蛋白含量
    1.1.3特点
    凯氏定氮法是测定蛋白含量的经典方法，其测定结果比较准确，该法灵敏度高，最低可检出0.05mg氮，且样品用量少；精密度、准确度高，平行误差一般小于0.5%；应用范围广，应用于一切形态的食品与生物样品，尤其对于不溶和浑浊的样品，凯氏法也可以测定。但测定需要经过消化、蒸馏、吸收、滴定等步骤，手续繁琐，耗费时间长。并且凯氏定氮法实际上测定的不是蛋白质的含量，是通过测定氮含量来推算蛋白质的含量，因此测得的是粗蛋白，不能够区分蛋白氮和非蛋白氮。1.1.4应用

    韩博[1]等人运用凯氏法测定了大豆中粗蛋白的含量，实验采自中国不同地区的162种大豆样品作为试验材料，分别采用了凯氏法和杜马斯燃烧法测定其粗蛋白含量，分析了两种方法的差异，以确定一种快速安全的测定饲料原料粗蛋白含量的方法。结果表明，二者差异不大，在本实验中所选定的样品范围内，两种方法可以互相代替。
    鲁健章[2]等人运用凯氏定氮法测定了鱼类中蛋白质含量，并分析了该法测不准蛋白含量的原因并探讨了改进措施。在此试验中，共统计了30种不同种属的鱼类（海水鱼类和淡水鱼类）的非氨基酸态氮的含量，发现不同种属间非氨基酸态氮的含量差异很大（2%-30%），及时是同一种属的鱼类，其非氨基酸态氮含量差异也很大（变异系数多为50%左右）。故探讨了该法的改进措施，可采用挥发性盐基氮的测定方法（GB/T5009.44-2003）使用凯氏定氮装置在碱性溶液中将非氨基酸态氮蒸馏出来，以硼酸溶液回收。回收的非氨基酸态氮含量采用凯氏定氮法测定，计算非氨基酸态的质量分数。
    王宗乾[3]等人运用凯氏定氮法分析牛奶蛋白纤维中的氮含量。尝试以含氮量变化来表征因染整加工而引起的纤维中蛋白组分的变化，并通过正交试验优化了凯氏定氮的消化工艺。1.2考马斯亮蓝法
    考马斯亮蓝(CoomassieBrilliantBlue法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。1.2.1实验原理
    考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究[4]发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸和芳香族氨基酸残基相结合。1.2.2实验步骤1.2.2.1标准曲线的绘制取7支试管，按下表平行操作。

    试管编号标准蛋白溶液（mL）0.15mol/LNaCl（mL）考马斯亮蓝试剂（mL）
    0123456
    00.010.020.030.040.050.06
    0.10.090.080.070.060.050.04
    5mL
    摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色
    A595nm





    绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
    1.2.2.2样品蛋白浓度的测定
    测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL。1.2.3特点
    蛋白质分子都具有酰胺基团，棕红色的考马斯亮蓝G-250染料上的阴离子与蛋白质的酰胺基团结合，使溶液变为蓝色，而且这种蓝色溶液相对很稳定，在1h内吸光度值变化很小，且与传统分析方法相比，该方法操作简便、经济且结果较为准确尤其适合测定低浓度的蛋白质样品。该法灵敏度高、重现性好，是测定乳品蛋白质的有效方法。1.2.4应用
    孙士青[5]等人采用考马斯亮蓝G-250染料染色法对市售乳品中蛋白质进行测定，结果表明，供试乳品溶液中蛋白质含量在10-80μg/ml范围内时，用考马斯亮蓝法测定其中的蛋白质含量效果比较好。
    董娜[6]等人采用考马斯亮蓝法测定奶粉中真蛋白的含量，实验结果表明，考马斯亮蓝法可排除添加非蛋白含氮物对奶粉真蛋白含量测定的影响，可以快速、

    准确的测定奶粉真蛋白含量。
    杨正坤[7]等人采用考马斯亮染色法测定大豆茎叶中蛋白质含量，结果表明该法是可行的。测得大豆茎叶蛋白质平均含量在7.673%和11.315%，相比其他传统方法，具有更大的优势。
    董文茜[8]等人采用双缩脲法和考马斯亮蓝法对蛇毒蛋白含量进行了测定。试验以蝰蛇毒为载体，结果表明，双缩脲法测得的蝰蛇毒蛋白含量范围在19.49%-25.69%，而考马斯亮蓝法测得的蛋白含量范围在79.53%左右，明显后者比前者更有优势。1.3双缩脲方法1.3.1实验原理
    双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
    紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，蛋白质的浓度越高，体系颜色越深，据此可用吸收光度法测蛋白质含量。蛋白质中的肽键与碱及少量硫酸铜溶液作用生成的紫红色配合物，在560nm处具有最大吸收波长。将未知浓度的样品溶液与一系列已知浓度的标准蛋白溶液同事与双缩脲实际反应，并于560nm处比色，可通过标准浓度蛋白质绘制的标准曲线，求得未知样品蛋白质的浓度。1.3.3特点
    本法操作简便、迅速，蛋白质浓度与光密度的线性关系好，是蛋白质浓度分析的常用方法之一，可快速测定蛋白质的含量。该方法测定范围为1-20mg蛋白质，灵敏度低，一般适用于需要快速，但精确度要求不高的蛋白质含量的测定。1.3.4应用
    张丽娟[9]等人运用双缩脲法检测了大豆分离蛋白中蛋白质含量。结果表明，当大豆蛋白质含量在0-120mg的范围内，线性关系比较好，吸光度值为0-0.596变异系数小，重现性高。
    由于该法只适合于那些对精度要求不高的蛋白质含量的测定，故其局限性

    较大，应用范围窄。1.4Folin-酚法1.4.1实验原理
    此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin-酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin-酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。1.4.3特点
    虽然这一试剂以灵敏度高、操作简便而得到推荐，但并不适合普遍的生物化学应用。
    福林酚法主要有两个缺点，（1）显色量随蛋白质的不同有所差异。从这一方面，福林反应的稳定情况不如双缩脲反应，但高于测定280nm处的吸收；（2）色与浓度并不呈严格的比例关系。该方法灵敏度高，为测定280nm处紫外吸收的10-20倍，特异性更强且对浊度干扰较不敏感而，且样品不需要消化。1.4.4应用
    黄百芬[10]等人运用福林-酚试剂法测定冰茶栓中微量蛋白的含量。样品经乙醇溶解，用水提取其中的蛇毒蛋白，经福林-酚试剂衍生后比色测定，于630nm处比色，测定吸光度值。结果显示，衍生波长在590-635nm之间，吸光度呈缓慢上升的趋势，故选定630nm作为测定波长；温度在30-40℃之间有较大吸收，故选定40℃为测定温度；福林-乙试剂的加量为500μl时为最佳加量；衍生产物在30-150min之间基本稳定，略有下降，故选定30min为衍生时间。
    卜彦花[11]等人采用了福林酚试剂法和紫外分光光度法测定冬枣多酚含量，并对这两种方法进行了比较。试验表明，紫外分光光度测定法的线性范围为1375-12500mg/kg，而福林酚试剂测定法的线性范围为7500-15000mg/kg。明显前者的检出限和定量限都显著低于后者，但通过测定回收率，发现这两种测定方法都具有良好的精密度和准确度。并且，采用福林酚发测定冬枣的多酚含量明显高于紫外分光光度法。

    Lowry.O.H.[12]等人采用福林酚试剂测定了兔全组织和组织提取物中蛋白含量，并且与凯氏法测蛋白进行了比较，结果显示，二者的测定结果相近。1.5紫外吸收法1.5.1实验原理
    蛋白质中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的能力。特征吸收峰在280nm波长处。各种蛋白质都含有酪氨酸，因此在280nm处具有吸光度是蛋白质的一种普遍性质。在一定的范围内，蛋白质溶液在280nm处的吸光度与其浓度成正比，因此可用于蛋白质的定量测定[13]。1.5.3特点
    紫外吸收法简便灵敏快速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，因此在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛应用。但在测定与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。如果样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。核酸在紫外区也有强吸收，但通过校正可以消除。1.5.4应用
    该法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似度蛋白质，此外，由于蛋白质的吸收峰常因pH的改变而变化，因此测定样品时的pH值要与测定标准曲线的pH值一致。
    陈婉玉[14]等人采用紫外分光光度法测定了蜂王浆中粗蛋白的含量。试验中，具体采用凯氏法和紫外法测定了30份来自不同产地的蜂王浆的粗蛋白含量，并分别绘制由牛血清清蛋白与已知粗蛋白含量的蜂王浆做标准蛋白的标准曲线，由此得到两个线性回归方程。结果表明，紫外法测得的蜂王浆中粗蛋白的含量与凯氏法测得的蛋白含量，经多重比较均没有明显差异。但由于各蜂王浆间具有差异性，所以采用牛血清清蛋白作为蛋白质标样更具有代表性。1.6杜马斯燃烧法1.6.1实验原理
    样品在纯氧环境中高温燃烧，其杂质被还原剂吸收，释放出的氮气由热导检测仪（TCD）进行检测，得到总氮含量结果，乘以相应的转换系数则为蛋白质

    的含量。基于此原理，杜马斯燃烧法能够在4-6min中内准确地测定出样品的总氮含量，进而计算出样品蛋白质含量[15]。1.6.3特点
    该法测定蛋白含量结果稳定。且实验过程中，其前处理简单，时间短，成本低，能够自动连续大批量检测，且避免造成环境污染。不仅适用于蛋白含量在10g/100g以上的粮食、豆类、米粉、奶粉、蛋白质粉等固体试样的筛选测定，还适用于蛋白质含量在10g/100g以下的食品蛋白质含量的测定。1.6.4应用
    杜马斯燃烧法已经被美国、德国、英国、日本等发达国家采用，作为饲料粗蛋白的官方测定方法。GB5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定NationalfoodsafetystandardDeterminationofproteininfoods》[16]于2010年6月1日起实施，标准与国标GB/T5009.5-2003相比增加了燃烧法作为第三法用于蛋白质含量在10g/100g以上的粮食、豆类、奶粉、米粉、蛋白质粉等固体试样的筛选测定。
    赵玉富等人运用杜马斯燃烧法，以各类食品，包括奶粉和淀粉等其他类型试样和饲料作为试验材料，分析了各种参数，包括称样量的选择、氧气流量和同样时间的选择等对杜马斯燃烧法测定蛋白含量的影响，并比对了杜马斯燃烧法和凯氏定氮法的测定结果。结果显示，大部分食品样品杜马斯燃烧法和凯氏法无显著差异。
    田培[17]等人运用杜马斯燃烧法测定花生、大豆、油菜籽、芝麻和菜籽饼粕等油料样品中粗蛋白含量，测定结果准确，重现性好。
    杨雪娇[18]等人运用杜马斯燃烧法测定了黄豆、米粉、奶粉等固体试样中蛋白含量，其流程和结果与田培等人的实验结果类似，此处不再赘述。另外，杨雪娇等人还运用该法测定了液体食品中蛋白质的含量。但不同于固体样品，液体样品测定时需提前制作成液体锡囊。为验证仪器测定液体时的准确度，将已知含氮量的奶粉（蛋白质含量为16.44%），调配成不同浓度的液态奶，采用液体锡囊进行测定。最终获得含氮量与奶粉溶液中理论蛋白质的含量接近。这说明杜马斯燃烧法测定液体蛋白含量的结果准确，可信度比较高。
    1.7高效液相色谱法（High-PerformanceLiquidChromatography,HPLC）

    1.7.1实验原理
    高效亲和色谱在生物大分子分析与生物大分子纯化等领域运用广泛并效果较好。在生物体内许多大分子具有与某些相对应的专一分子可逆结合的特性，生物分子之间的这种特异结合力成为亲和力，根据分子间亲和吸附和解离的原理，建立起来的色谱法成为亲色谱法。而高效液相色谱法就是在解吸附的过程中，用某种缓冲液或溶液洗脱亲和柱，把吸附在亲和柱上的欲纯化物质洗脱出来，之后由检测器将信号输出。1.7.3特点
    相比其他传统蛋白测定方法，该法具有更高的灵敏度、分析速度快，并且不仅可以将蛋白含量检测出来，还可将各组分分离出来，方便快捷。1.7.4应用
    马燕芬[19]等人采用该法测定牛初乳中IgG的含量，并与琼脂双扩散法进行比较，目的是筛选出一种快速、精确测定IgG含量的方法。试验方法是在牧场随选取7头体况良好、体重、胎次及分娩日期都想进的黑白花奶牛作为试验研究对象，结果表明，与琼脂双扩散法比较，高效液相色谱法测定牛乳蛋白中IgG含量具有更优的结果。
    高旭[20]采用该法测定了婴幼儿乳制品中免疫球蛋白IgG的含量。实验确定的色谱条件是检测波长280nm，流速0.4ml/min，柱温25℃，结合液A位pH=6.7的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液，洗脱液B为pH=2.7的0.05mol/L的甘氨酸盐缓冲液。结果得到优于国标的IgG色谱峰。1.7其他方法
    除了上述蛋白测定方法，还有其他一些蛋白含量测定方法。
    唐伟英[21]等人还采用电位滴定法牛乳中蛋白质的含量。用甲醛固定蛋白质中的氨基从而释放出游离的羧基，并用氢氧化钠标准溶液滴定，通过测定牛乳中蛋白质的游离氨基酸的含量，可以计算蛋白质中的氮含量，从而求得牛乳中蛋白质的含量。2结论
    食品中测定蛋白含量的方法有很多，但常用的方法有6种：凯氏定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、杜马斯燃烧法、Folin-酚法，另外近些年还新兴起其他

    的蛋白测定方法，例如甲醛滴定法，反相高效液相色谱法等。
    凯氏定氮法是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国内外作为法定的标准检验方法；双缩脲、Folin-酚法、考马斯亮蓝法主要利用试剂和蛋白质中氨基酸肽键进行缩合形成呈特定颜色的缩聚物来测定食品中的蛋白质含量。但上述方法都有一个共同的特点，检测周期长。无论是凯氏定氮法，还是分光光度法，都需要将样品粉碎后，进行消化或者水解，消耗2-6个小时不等，在进行滴定或者比色，又需耗时30min左右，对于样品量大，时效性强的单位，以上方法均很难符合要求。而2010年新增的杜马斯燃烧法，具有样品处理简单，测试速度快（每个样品测试时间3-6min），精度好，重现性好等优点。


    参考文献
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