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    引物设计原则(最全汇总)

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    引物设计原则（汇总）
    普通引物设计（适用于从载体上扩增模板） ：
    1. 普通引物长度一般在 20-30bp 之间，常用 24-28bp 左右以保证基因特异性；
    2. 下载基因序列到 Vector NTI ； 3. 找到所需安装载体序列； 4. 将基因序列的 CDS高亮标记； 5. 寻找载体序列中常用酶切位点，一般为 EcoRI、 BamHI 、 HindIII 、XhoI 等等，比对检测
    基因序列中是否有这些位点，有的话舍弃，最后选择两个酶切位点，最好离得远一点， 并且 最好
    buffer 用一样的。酶切位点一般是 6bp 的回文序列；
    6. 从基因 ATG开始往后选择 10-20bp均可（我的习惯是 27bp-6bp酶切位点 -2bp保护碱基
    -xbp 补齐序列），但最好保证最后两个是 G 或者 C，以减少错配率；
    7. 将上游酶切位点序列补在 ATG 前方，并根据载体对框情况补足两者之间的空缺，再根据
    序列的 GC 含量和 TM 值在酶切位点前补足保护碱基，以保证 GC 和 AT 的含量不能过高。 注意，所有的补齐不能用到终止密码子；
    8. 检测上游序列的结构情况，理论上不要太多二级结构以及 3'端匹配即可；不过重复的序
    列也不能太多，以免移码；
    9. 从下游终止密码子开始向前选择 10-20bp 均可，但最好保证最后两个是 G或者 C，以减少
    错配率；
    10. 选择 complementary sequence，在 N 端补齐下游酶切位点，如果 tag 在 C 端（即下游） ， 则在第 9 点中应该从终止密码子前开始选择 （即舍弃终止密码子） ，并且下游引物也要对框， 如果 tag 在 N 端，则下游引物不需要对框，只要在 N 端加上下游酶切位点，再根据情况加 上 2 个保护碱基，然后检测二级结构，原则上 多，以免移码；
    11. 将设计好的上下游引物放在一起检测二级结构，原则上 3'端部匹配即可。不过重复的
    3 '端部匹配即可。不过重复的序列也不能太
    序列也不能太多，以免移码；
    12. 最后在 NCBI 的 primer Blast 网站上比对引物序列，看是否基因特异性的。
    2011 年 10 月 18 日
    左洁
    1. 引物的长度一般为 15-30 bp ，常用的是 18-27 bp ，但不应大于 38，因为过 长会导致其延伸温度大于 74℃，不适于 Taq DNA聚合酶进行反应。
    2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3'端相似性较高的序列， 否则容易导致错配。引物 3'端出现 3个以上的连续碱基，如 GGG或 CCC，也会
    使错误引发机率增加。
    3. 引物 3'端的末位碱基对 Taq 酶的 DNA合成效率有较大的影响。不同的末位 碱基在错配位置导致不同的扩增效率， 末位碱基为 A 的错配效率明显高于其他 3 个碱 基，因此应当避免在引物的 3'端使用碱基 A。另外， 引物二聚体或发夹结 构也可能导致 PCR反应失败。 5'端序列对 PCR影响不太大，因此常用来引进修 饰位 点或标记物。
    4. 引物序列的 GC含量一般为 40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游 引物的 GC含量不能相差太大。
    5. 引物所对应模板位置序列的 Tm值在 72℃左右可使复性条件最佳。 Tm值的计 算有多种方法，如按公式 Tm＝4（G+C）＋2（A+T） ，在 Oligo 软件中使用的是最邻 近法（the nearest neighbor method） 。
    6. ΔG值是指 DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的

    相对稳定性。应当选用 3'端ΔG值较低（绝对值不超过 9），而 5'端和中间 ΔG值相对较高的引物。引物的 3'端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链 结构并引发 DNA聚合反应。
    7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过 4.5kcal/mol ）易导致产生引物二 聚体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR反应不能正常进行。
    8. 对引物的修饰一般是在 5'端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入 PCR 产物的载体的相应序列而确定。
    引物序列应该都是写成 5-3 方向的，
    Tm之间的差异最好控制在 1度之内， 另外我觉得扩增长度大一些比较好， 500bp左右。
    要设计引物首先要找到 DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否 形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构， 就要避开它。如这一段不能形 成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
    ① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ② 产物不能形成二级结构。 ③ 引物长度一般在 15~30碱基之间。 ④ G+C含量在 40%~60%之间。 ⑤ 碱基要 随机分布。 ⑥ 引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。 ⑦ 引物之间不能有连续 4个碱基的互补。 ⑧ 引物 5′端可以修饰。 ⑨ 引物 3′端不可修饰。 ⑩ 引 物 3′端要避开密码子的第 3位。
    1. 引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过 70%或有连续 8个互
    补碱基同源。
    2. 避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区 DNA二级 结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可 以预测估计 mRNA的稳定二级结构， 有助于选择模板。实验表明，待扩区域 自由能（△ G°）小于 58.6lkJ/mol 时，扩增往往不能成功。若不能避开这一 区域时，用 7-deaza- 2′- 脱氧 GTP取代 dGTP对扩增的成功是有帮助的。 3. 长度寡核苷酸引物长度为 15~30bp，一般为 20~27mer。引物的有效长度： Ln=2（G+C） +（A+T）， Ln值不能大于 38，因为＞38时，最适延伸温度会超
    过 Taq DNA聚合酶的最适温度（ 74℃）, 不能保证产物的特异性。
    4. G+C含量 G+C含量一般为 40%~60%。其 Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在 一定盐浓度条件下， 50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于 Tm值 5~10℃。若按公式 Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的 Tm值，则有效引 物的 Tm为 55~80℃，其 Tm值最好接近 72℃以使复性条件最佳。
    5. 碱基础随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚 嘧啶的存在。尤其 3′端不应超过 3个连续的 G或 C，因这样会使引物在 G+C 富集序列区错误引发。
    6. 引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构 牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。 若用人工判断，引物自 身连续互补碱基不能大于 3bp。 7. 引物之间两引物 之间不应不互补性，尤应避免 3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一 对引物间不应多于 4 个连续碱基的同源性或互补性。 8. 引物的 3′端引物 的延伸是从 3′端开始的，不能进行任何修饰。 3′端也不能有形成任何二级

    结构可能，除在特殊的 PC（R AS-PCR）反应中，引物 3′端不能发生错 配。 在 标准 PCR反应体系中，用 2U Taq DNA聚合酶和 800μmol/L dNTP（四种 dNTP 各 200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按 95℃，25s；55℃，25s；72℃， 1min 的循环参数扩增 HIV- 1 gag 基因区的条件下，引物 3′端错配对扩增产 物的影响是有一定规律的。 A∶A错配使产量下降至
    1/20 ，A∶G和 C∶C错七 下降至 1/100 。引物 A： 模板 G与引物 G：模板 A错配对 PCR影响是等同的。
    9. 引物的 5′端 引物的 5′端限定着 PCR产物的长度，它对扩增特异性影响 不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物 5′端修饰包括：加 酶切位点；标记生物素、 荧 光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合 DNA序列； 引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。 10. 密码子的 简并 如扩增编码区域，引物 3′端不要终止于密码子的第 3 位，因密码子的 第 3 位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
    Hairpin 发卡结构 如果自由能值大于 0 则该结构不稳定从而不会干扰反应如果自由能值小于 0 则该结构可以干扰反应 二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向。引物之间形成如果配对区域在 3 末端问题会更为严重 3 末端配对很容易引起引物二聚 体扩增使
    Pair Rating 匹配度评分匹配度低的引物对常常不太有效是因为在同样退火 温度下 Tm低的引物决定扩增的特异性而 Tm高的引物更易于形成非特异性结 合而造成错误的起始
    【1】引物的长度以 15－30bp 为宜，否则会影响扩增的特异性。
    【 2】 】碱基尽可能随机分布，避免相同的碱基成串排列，引物的 G+C含量 在 40％－ 60％之间，若 G+C含量太低，可在 5"端加上一些 G或 C，若 G＋C 含量太高，可在 5" 端加上一些 A或 T。
    【3】 应避免每条引物内部形成二级结构及两条引物的 3" 端互补形成引物二 聚体，避免在引物的 3" 端有 3 个 G或 3 个 C成串排列， 3" 端的末位碱基最好 选 T、C、G,而不选 A，也有建议在引物的两端用 1－2 个嘌呤 碱基。 【 4】 尽可能使用两条引物的 Tm值相同（最好相差不要超过 5℃），退火温 度根据较低的 Tm值选定，也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火 温度。 Tm值可 以根据 Tm=4（G+C）+2（A+T计） 算。而对于较长的引物， Tm值需 要考虑动力学参数、从“最近邻位”的计算方式得到，现有的 PCR引物设计
    软件大 多数都采用这种方式。（注：对于 Tm值的计算有争议的地方是附加 序列应不应该计算在内，我觉得有值得商讨的地方。因为从理论上只有最开 始的循环引物的附加 序列是不与模板链结合的， 而在后来的 PCR反应中，引 物的附加序列是和模板链结合了的。）
    【 5】 引物的 3'端要与模板严格配对， 而 5'端碱基没有严格的限制， 只要 与模板 DNA结合的部分足够长，其 5'端碱基可不与模板 DNA配对而呈游离 状态，这样， 我们可以在引物的 5 末端加上酶切位点（引入酶切位点时，要 考虑到进行双酶切的共用缓冲液，否则给下游工作带来困难）、启动子，方 便下游操作。
    【 6】 不要在扩增序列的二级结构区设计引物，以免退火困难。也要考虑引 物设计处模板的特异性。
    引物设计原则

    1. 引物的长度一般为 15-30 bp，常用的是 18-27 bp，但不应大于 38，因为过长
    会导致其延伸温度大于 74℃，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应。
    2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3'端相似性较高的序列，否
    则容易导致错配。 引物 3'端出现 3个以上的连续碱基， 如 GGG或 CCC，也会使 错误引发机率增加。
    3. 引物 3'端的末位碱基对 Taq酶的 DNA 合成效率有较大的影响。
    不同的末位碱 基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为 A 的错配效率明显高于其他 3 个碱基，因此应当避免在引物的 3'端使用碱基 A 。另外，引物二聚体或发夹结构 也可能导致 PCR反应失败。 5'端序列对 PCR影响不太大，因此常用来引进修饰 位点或标记物。
    4. 引物序列的 GC 含量一般为 40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游
    引物的 GC 含量不能相差太大。
    5. 引物所对应模板位置序列的 Tm 值在 72℃左右可使复性条件最佳。 Tm 值的计
    算有多种方法，如按公式 Tm＝4(G+C＋ 2(A+T ，在 Oligo 软件中使用的是最邻 近法(the nearest neighbor method。
    6. ΔG值是指 DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的
    相对稳定性。应当选用 3'端 ΔG值较低(绝对值不超过 9，而 5'端和中间 ΔG 值相对较高的引物。 引物的 3'端的 ΔG值过高， 容易在错配位点形成双链结构并 引发 DNA 聚合反应。
    7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过 4.5kcal/mol易导致产生引物二聚
    体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能正常进行。
    8. 对引物的修饰一般是在 5'端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入
    PCR 产物的载体的相应序列而确定。 引物序列应该都是写成 5-3 方向的，
    Tm 之间的差异最好控制在 1 度之内， 另外我觉得扩增长度大一些比较好， 500bp 左右。
    要设计引物首先要找到 DNA 序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是 否形成二级结构。 如这个区域单链能形成二级结构， 就要避开它。 如这一段不能 形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。

    ① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ② 产物不能形成二级结构。 ③ 引物长度一般在 15~30碱基之间。 ④ G+C含量在 40%~60%之间。 ⑤ 碱基 要随机分布。 ⑥ 引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。 ⑦ 引物之间不能有连 续 4 个碱基的互补。 ⑧ 引物 5′端可以修饰。 ⑨ 引物 3′端不可修饰。 ⑩ 引物 3′端要避开密码子的第 3 位。
    1. 引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过 70%或有连续 8 个互
    补碱基同源。
    2. 避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区 DNA 二级结
    构的影响， 选择扩增片段时最好避开二级结构区域。 用有关计算机软件可以预测 估计 mRNA 的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能
    （△ G°）小于 58.6lkJ/mol 时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用 7-deaza-2′-脱氧 GTP 取代 dGTP对扩增的成功是有帮助的。
    3. 长度 寡核苷酸引物长度为 15~30bp，一般为 20~27mer。引物的有效长度： Ln=2 （G+C）+（A+T），Ln值不能大于 38，因为＞38 时，最适延伸温度会超过 Taq DNA 聚合酶的最适温度（ 74℃）,不能保证产物的特异性。
    4. G+C含量 G+C含量一般为 40%~60%。其Tm 值是寡核苷酸的解链温度， 即在
    一定盐浓度条件下， 50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于
    Tm值 5~10℃。若按公式 Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的 Tm 值，则有效
    引物的 Tm 为 55~80℃，其 Tm 值最好接近 72℃以使复性条件最佳。
    5. 碱基础随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧
    啶的存在。尤其 3′端不应超过 3个连续的 G或 C，因这样会使引物在 G+C富集 序列区错误引发。
    6. 引物自身 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙
    引物本身复性。 这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。 若用 人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于 3bp。
    7. 引物之间 两引物之间不应不互补性，尤应避免 3′端的互补重叠以防引物二聚
    体的形成。一对引物间不应多于 4 个连续碱基的同源性或互补性。
    8. 引物的 3′端 引物的延伸是从 3′端开始的， 不能进行任何修饰。 3′端也不
    能有形 成任何二级结构可能，除在特殊的 PCR（AS-PCR）反应中，引物 3′端不能发生 错配。 在标准 PCR反应体系中，用 2U Taq DNA 聚合酶和 800μmol/L dNTP（四 种 dNTP 各 200μ mol/L）以质粒（ 103 拷贝）为模板，按 95℃， 25s； 55℃， 25s； 72℃，1min 的循环参数扩增 HIV-1 gag 基因区的条件下，
    引物 3′端错配对扩增产 物的影响是有一定规律的。 A∶A 错配使产量下降至
    1/20，A∶G和 C∶C错七 下降至 1/100。引物A：模板 G与引物 G：模板 A错配对 PCR影响是等同的。 9. 引物的 5′端 引物的 5′端限定着 PCR 产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因 此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物
    5′端修饰包括：加酶切位点；标记 生物素、荧光、地高辛、 Eu3+等；引入蛋白质结合 DNA 序列；引入突变位点、 插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。 10.密码子的简并 如扩增编码区 域，引物 3′端不要终止于密码子的第 3 位，因密码子的第 3 位易发生简并，会影 响扩增特异性与效率。
    Hairpin 发卡结构
    如果自由能值大于 0 则该结构不稳定从而不会干扰反应如果自由能值小于 0 则 该结构可以干扰反应 二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向。引物之间形成如果配对区域在 3 末端问题会更为严重 3 末端配对很容易引起引物二聚 体扩增使
    Pair Rating 匹配度评分匹配度低的引物对常常不太有效是因为在同样退火温度 下 Tm 低的引物决定扩增的特异性而 Tm 高的引物更易于形成非特异性结合而造
    成错误的起始
    【1】引物的长度以 15－30bp 为宜，否则会影响扩增的特异性。
    【 2】 】碱基尽可能随机分布，避免相同的碱基成串排列，引物的 G+C 含量在
    40％－60％之间，若 G+C含量太低，可在 5'端加上一些 G或C，若 G＋C含量
    太高，可在 5'端加上一些 A 或 T。
    3】 应避免每条引物内部形成二级结构及两条引物的 3'端互补形成引物二聚 体，避免在引物的 3'端有 3 个 G 或 3 个 C 成串排列， 3'端的末位碱基最好选 T、 C、G,而不选 A，也有建议在引物的两端用 1－2 个嘌呤碱基。
    【4】 尽可能使用两条引物的 Tm 值相同（最好相差不要超过 5℃），退火温度 根据较低的 Tm 值选定，也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火温 度。 Tm值可以根据 Tm=4（G+C）+2（A+T）计算。而对于较长的引物， Tm 值
    需要 考虑动力学参数、从 “最近邻位 ”的计算方式得到，现有的 PCR引物设计软件大 多数都采用这种方式。 （注：对于 Tm 值的计算有争议的地方是附加序列应不应 该计算在内， 我觉得有值得商讨的地方。 因为从理论上只有最开始的循环引物的 附加序列是不与模板链结合的，而在后来的 PCR 反应中，引物的附加序列是和 模板链结合了的。）
    【 5】 引物的 3'端要与模板严格配对，而 5'端碱基没有严格的限制，只要与模 板 DNA 结合的部分足够长，其 5'端碱基可不与模板 DNA 配对而呈游离状态， 这样，我们可以在引物的 5 末端加上酶切位点 （引入酶切位点时， 要考虑到进行 双酶切的共用缓冲液，否则给下游工作带来困难）、启动子，方便下游操作。 【 6】 不要在扩增序列的二级结构区设计引物， 以免退火困难。 也要考虑引物设 计处模板的特异性。
    PCR 引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模 板 DNA 序列。因此，引物的优劣直接关系到 PCR 的特异性与成功与否。 要设计引物首先要找到 DNA 序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是
    否形成二级结构。 如这个区域单链能形成二级结构， 就要避开它。 如这一段不能 形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。 现在可以在这一保守区域里设计一对引物。 一般引物长度为 15~30 碱基，扩增片 段长度为 100~600 碱基对。
    让我们先看看 P1 引物。一般引物序列中 G C 含量一般为 40%~60%。而且四种 碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则 P1 引物设计的就不合 理。应重新寻找区域设计引物。
    同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于 4 个连续碱基的互补。 引物确定以后， 可以对引物进行必要的修饰， 例如可以在引物的 5′端加酶切位点 序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但 3′端绝 对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从 3′端开始的。这里还需提醒的是 3′ 端不要终止于密码子的第 3 位，因为密码子第 3位易发生简并，会影响扩增的特
    异性与效率。
    综上所述我们可以归纳十条 PCR 引物的设计原则： ① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
    ② 产物不能形成二级结构。
    ③ 引物长度一般在 15~30 碱基之间。

    ④ G C 含量在 40%~60%之间。 ⑤ 碱基要随机分布。
    ⑥ 引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。 ⑦ 引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。 ⑧ 引物 5′端可以修饰。 ⑨ 引物 3′端不可修饰。
    ⑩ 引物 3′端要避开密码子的第 3 位。
    PCR 引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板 DNA 序列。如前述，引物的优劣直接关系到 PCR 的特异性与成功与否。对引物 的设计不可能有一种包罗万象的规则确保 PCR 的成功，但遵循某些原则，则有
    助于引物的设计。
    1. 引物的特异性
    引物与非特异扩增序列的同源性不要超过 70%或有连续 8 个互补碱基同源。
    2. 避开产物的二级结构区
    某些引物无效的主要原因是引物重复区 DNA 二级结构的影响，选择扩增片段时 最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计 mRNA 的稳定二级结 构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△ G°）小于 58.6lkJ/mol 时， 扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用 7-deaza-2′-脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增的成功是有帮助的。
    3. 长度
    寡核苷酸引物长度为 15~30bp，一般为 20~27mer。引物的有效长度： Ln=2（G C） （A T ，Ln值不能大于 38，因为＞38时，最适延伸温度会超过 Taq DNA 聚合酶 的最适温度（ 74℃）,不能保证产物的特异性。
    4. G C 含量
    G C 含量一般为 40%~60%。其 Tm 值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度 条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度， 有效启动温度，一般高于 Tm值 5~10℃ 若按公式 Tm=4（G C）2（A T）估计引物的 Tm 值，则有效引物的 Tm为 55~80℃， 其 Tm 值最好接近 72℃以使复性条件最佳。
    5.     碱基础随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其
    3′

    端不应超过 3个连续的 G或 C，因这样会使引物在 G C富集序列区错误引发。
    6. 引物自身
    引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复 性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断， 引物自身连续互补碱基不能大于 3bp。
    7. 引物之间
    两引物之间不应不互补性， 尤应避免 3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成 对引物间不应多于 4 个连续碱基的同源性或互补性。
    8. 引物的 3′端
    引物的延伸是从 3′端开始的，不能进行任何修饰。 3′端也不能有形成任何二级结 构可能，除在特殊的 PCR（AS-PCR）反应中，引物 3′端不能发生错配。 在标准 PCR反应体系中，用 2U Taq DNA 聚合酶和 800μmol/L dNTP（四种
    dNTP 各 200μmol/L）以质粒（ 103 拷贝）为模板，按 95℃，25s；55℃， 25s；72℃， 1min 的循环参数扩增 HIV-1 gag 基因区的条件下， 引物 3′端错配对扩增产物的影 响是有一定规律的。 A∶A 错配使产量下降至 1/20，A∶G 和 C∶C 错七下降至 1/100。引物 A：模板 G与引物 G：模板 A 错配对 PCR影响是等同的。
    9. 引物的 5′端
    引物的 5′端限定着 PCR 产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被 修饰而不影响扩增的特异性。引物 5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧 光、地高辛、 Eu3 等；引入蛋白质结合 DNA 序列；引入突变位点、插入与缺失 突变序列和引入一启动子序列等。
    10. 密码子的简并
    如扩增编码区域， 引物 3′端不要终止于密码子的第 3位，因密码子的第 3 位易发 生简并，会影响扩增特异性与效率。
    特殊目的的引物设计将在有关章节讨论。 随着人们对引物的认识， 一些引物的计 算机设计程序也应运而生，下面将讨论有关引物计算机设计方法
    引物设计重点考虑因素、设计技巧及引物设计软件推荐
    urbest 发表于
    2007-07-14 16:35
    我最近合成了几十对引物， ，在实战中多多少少有些心得，拿出来给大家分享。我感觉 想把引物合成的比较好， 除了前引物和后引物的 Tm 不能相差太大， 我们还要重点考虑以下 因素：
    一、 GC% GC 含量
    对于 PCR 反应来说 GC 含量在 40%— 60%，一般 50% 左右比较合适；而对于测序引物 和杂交探针来说 GC 含量至少应为 50%。产物中 GC 含量最好大于引物中的 GC 含量。
    二、 Degeneracy 多义性 当设计多义引物时应尽量减少引物多义性，这样会带来更好的特异性，应尽量避免 3 末端的多义性，因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。
    三、 3' End Stability 3 末端稳定性 引物稳定性影响它的错配效率，一条理想的引物应该有一个稳定性较强的 5 末端和相 对稳定性较弱的 3 末端。如果引物 3 稳定性强，有可能在即使 5 末端不配对的情况下造成 错配，形成非特异性扩增条带( secondary bands 。而 3 末端稳定性低的引物较好的原因 是在引物发生错配时，由于 3 末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸。 四、 GC Clamp GC 钳
    引物与目的位点的有效结合需要有稳定的 5 末端。这一段有较强稳定性的 5 末端称为 GC 钳。它保证引物与模板的稳定结合。选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性 条带的前提下尽量降低退火温度。
    五、 Secondary Structures 二级结构 二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素。 二级结构能显著影响反应中能与模板 正确结合的引物数量， 发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力， 从而降低扩增效 率，形成发卡环的引物则不能在 PCR 扩增中发挥作用。
    六、 Hairpin 发卡结构 发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成引物折叠形成的二级结构， 并由于发卡结构的形成是分子内的反应 ,仅仅需要三个连续碱基配对就可以形成。发卡结构
    的稳定性可以用自由能衡量。自由能大小取决于碱基配对释放的能量以及折叠 DNA 形成发 卡环所需要的能量，如果自由能值大于 0 则该结构不稳定从而不会干扰反应，如果自由能 值小于 0 则该结构可以干扰反应。
    七、 Dimer 二聚体
    引物之间的配对区域能形成引物二聚体， 它是相同或不同的两条引物之间形成的二级结 构。它造成引物二聚体扩增并减少目的扩增产物， 二聚体可以在序列相同的两条引物或正反 向引物之间形成，如果配对区域在 3 末端问题会更为严重， 3 末端配对很容易引起引物二 聚体扩增。
    八、 False Priming 错配
    如果引物可以结合除目的位点外的其他区域， 扩增效率将明显降低目的产物带将减少或 出现涂布 ( smear。3 末端连续几个碱基配对形成错配的倾向要高于引物上游区域同样数量 的碱基配对，在使用引物设计软件时，您可以分别设定确认为错配的 3 末端或引物全长形 成连续碱基配对的数量。
    顺便说一下，如果是新手，刚开始接触引物设计，推荐使用 Primer Premier 5.0 ，因为它 界面简单，易学易用；如果你想把引物设计得尽善尽美，公认的首选软件是
    Oligo ，其次我
    认为是 DNAstar 。 Oligo 功能强大，所以使用起来就没有 Primer Premier 5.0 那么简便。先用
    Primer Premier 5.0 设计，然后把设计好的引物拿到 Oligo 里去检测这对引物的优劣，我想这
    对大多数引物设计者是一个不错的选择！
    本实验心得来自丁香园论坛，查看原帖 分享到 网友评论
    补充一：具体说一下引物中 GC 含量问题

    引物的 GC 含量一般为 40-60% ，以 45-55％为宜，过高或过低都不利于引发反应。 有一 些模板本身的 GC 含量偏低或偏高， 导致引物的 GC 含量不能在上述范围内，这时应尽量使 上下游引物的 GC 含量以及 Tm 值保持接近（上下游引物的 GC 含量不能相差太大） ，以有 利于退火温度的选择。如果 G-C 比例超出，则在引物的 5'端增加 As 或 Ts；而如果 A-T 比 例过高，则同样在 5'端增加 Gs 或 Cs。但也有认为：原来普遍认为 PCR 引物应当有 50% 的 GC/AT 比率的观点其实是不对的，以人基因组 DNA 为模板，用 81%AT 的引物可以产生 单一的、专一的、长 250bp，含有 70% AT 的产物。完全没有必要复杂地去计算产物和引物 的解链温度，
    PCR 引物的 GC/AT 比率应当等于或高于所要放大的模板的 GC/AT 比。
    发表于
    2014-12-18 您无权限看这个帖子，您的积分需要大于 5 如何获得积分？ 发表于
    2014-12-18 补充二： [b] 关于自由能问题（如何根据自由能判断引物质量） [/b]1 、 ΔG 值（自由能 ） 反映了引物与模板结合的强弱程度。 一般情况下， 引物的 ΔG 值最好呈正弦曲线形状， 即 5' 端和中间 ΔG 值较高，而 3'端ΔG 值相对较低，且不要超过 9（ΔG 值为负值，这里取绝 对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。 3′末端双链的 ΔG是 0～－ 2kcal/mol 时， PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－ 6 时只有 40%、 到－ 8时少于 20%、而－ 10 时接近于 0。2、引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过 4.5， 否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致 PCR 正常反应不能进行，与二聚 体相关的一个参数是碱基的分布， 3'端的连续 GGG 或 CCC 会导致错误引发。 二聚体形成 的能值越高越稳定， 越不符合要求。 与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。虽然有些带 有发夹环，其ΔG 为－3 kcal/mol 的自身互补引物也可以得到不错的结果， 但是如果它的 3′ 末端被发夹环占据时就很麻烦， 即会引发引物内部的延伸反应， 减少了参与正式反应引物的 数量。当然，如果发夹环在 5′末端对反应就没有多大的影响了。
    发表于
    2014-12-18 补充三：关于产物需要测序的 PCR 引物的设计问题
    在 DNA 测序的 PCR 中最好用 5′末端稳定 （ 如 GC 含量较多 ），而 3′末端不太稳定
    （如 AT 含量较多 ）的引物， 这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。
    这就是基于引物内部稳
    定性的经验之谈。其 3′末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的原因在于，接近或 在
    3′末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发
    DNA 合成，所
    以不会产生假产物。 因此， 为了有效地引发反应， 引物的 5′末端和中央部分必须与靶 DNA 也形成双链。与此相反，带有稳定的、 GC 丰富的 3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷 酸序列都与靶序列配对，只凭借其 3′末端与靶序列任何位点的牢固配合就可以引发反应， 产生非专一产物。无论如何，寡核苷酸
    3′末端最后 5 个核苷酸的稳定性小于－ 9 kcal/mol
    的，通常就是专一性的探针或引物。寡核苷酸 3′末端越不稳定，假引发的可能性越低。 以上内容基本涵盖了我设计引物的全部心得和体会， 现在全部拿出来给大家分享， 希望 对大家有所帮助！

    发表于
    2014-12-18 多谢了，刚开始接触 PCR，所以到这学学 发表于
    2014-12-18     thanks for sharing 发表于
    2014-12-18 谢谢 urbest，我想请问 1.设计多重 PCR，有什么经验可询吗？ 2.在 GENEBANK 中找到
    mRNA 序列，有 CDS ，STS 分别代表何意？设计引物时要考虑外显子、 内含子的位置吗？ 谢
    谢指教！
    发表于
    2014-12-18 多谢，我也是刚开始做 pcr，到这里来学习，但是在网上下载的软件，按说明安装了之 后为什么不能使用呢？
    发表于
    2014-12-18 很可能是你下载的软件不行， 或者是需要注册， 你还没有注册， 到网上找个注册机就好 了
    urbest 总结的不错！ Degeneracy 多译为“兼并性” 补充几点： 1、除了上面
    的因素还要考虑产物的自由能或待扩区域的自由能， 通过引物退火温度同产物退 火温度的差值来衡量， 20 度左右就可以。 2、要保证足够 的长度，这是引物设 计的首要原则，只有足够长度才能保证引物的特异性， 25 个左右。可以 blast 检验引物的特异性。 3 、多重引物的设计关键是两点： 1、引物间尽量无聚体形
    成，特别是头部。2、引物间长度不能相差太大， 但应能分开在跑胶时， 100－200bp 左右。才能 保证扩增效率的接近。
    3 引物不应有发夹结构。即不能有 4bp 以上的 回文 序列
    4 两引物间不应有大于 4pb 以上的互补序列或同源序列， 补碱基
    5 引物中碱基的分布尽可能均匀， G+C含量接近 50%3 引物内部链避免二级结构
    4 引物碱基序列不应与非扩增区域有同源性或少于连续 5 引物的 3‘端为关键碱基
    在 3'端不应有任何互 8 个的互补碱基

    免费下载 Word文档免费下载： 引物设计原则(最全汇总)

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