4.1 引言

某些物质被一定波长的光照射时，会在较短时间内发射出波长比入射光长的光，这种光就称为荧光。1852年， Stokes阐明了荧光发射的机制，认为荧光是由于物质吸收了光能而重新发出的波长不同的光，并由一种能发荧光的矿物 萤石(fluospar)而定名为荧光。

我们通常所说的荧光，是指物质在吸收紫外光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光，以及吸收波长较短的可见光后发出波长较长的可见荧光。除了紫外荧光和可见荧光，还有红外荧光、X射线荧光等。这不是本章要介绍的内容。

荧光光谱有两个主要优点：第一是灵敏度高。由于荧光辐射的波长比激发光波长长，因此测量到的荧光频率与入射光的频率不同。另外，由于荧光光谱是发射光谱，可以在与入射光成直角的方向上检测，这样，荧光不受来自激发光的本底的干扰，灵敏度大大高于紫外-可见吸收光谱。第二，荧光光谱可以检测一些紫外-可见吸收光谱检测不到的过程。紫外和可见荧光涉及的是电子能级之间的跃迁，荧光产生包括两个过程：吸收以及随之而来的发射。每个过程发生的时间与跃迁频率的倒数是同一时间量级(大约10-15秒)，但两个过程中有一个时间延搁，大约为10-9秒，这段时间内分子处于激发态。激发态的寿命取决于辐射与非辐射之间的竞争。由于荧光有一定的寿命，因此可以检测一些时间过程与其寿命相当的过程。例如，生色团及其环境的变化过程在紫外吸收的10-15秒的过程中基本上是静止不变的，因此无法用紫外吸收光谱检测，但可以用荧光光谱检测。

4.2基本概念和原理

4.2.1荧光的产生

吸收外来光子后被激发到激发态的分子，可以通过多种途径丢失能量，回到基态，这种过程一般称为弛豫。在很多情况下，分子回到基态时，能量通过热量等形式散失到周围。但是在某些情况下，能量能以光子发射的形式释放出来。

***Figure 5.3 Some pathways of relaxation from the excited state.***（P96）

上图（Campbell书中图5.3）表示了激发态分子的几种弛豫过程。由电子态基态被激发到第一电子激发态中各振动能级上的分子，一般会以某种形式(统称为内转换)丢失它们的部分能量，从第一电子激发态的不同振动能级以至从第二电子激发态等更高的电子激发态返回第一电子激发态的最低振动能级。这个过程大约为10-12秒。从第一电子激发态的最低振动能级返回基态的不同振动能级，如果能量以光子形式释放，则放出的光称为荧光。这个过程通常发生在10-6-10-9秒内。

由于荧光的频率低于入射光的频率，因此测量到的荧光频率与入射光的频率不同。同时，荧光是从与入射光成直角的方向上检测，这样荧光不受来自激发光的本底干扰，可以达到很高的灵敏度，一般比吸收光谱高两个数量级左右。此外，由于荧光有一定的寿命，且其寿命比紫外吸收的时间过程(10-15秒)要长，因此一些用紫外观测不到的变化过程(如生色团及其环境的变化)，恰好可以用荧光来观测。在紫外吸收的时间过程(10-15秒)中，生色团及其环境基本上是静止不变的。而在很多反应中，溶剂的重新排列和分子的运动过程发生的时间与激发态的寿命是同一量级。

4.2.2 磷光

如果某种物质在被某种波长的光照射以后能在较长的时间内发出比荧光波长更长的波长的光，则称这种光为磷光。

***Figure 5.3 Some pathways of relaxation from the excited state.***（P96）

磷光产生的机制与荧光是不同的，虽然它们都属于发射光谱，但磷光不是处于第一电子激发态的最低振动能级的分子直接释放出光子回到基态的结果，而是从某种能量低于第一电子激发态的最低振动能级的另一种亚稳能级三重态向基态的各振动能级以辐射方式产生跃迁时发出的光。

所谓三重态或三线态，是指分子中电子自旋量子数S=1，即原来两个配对的自旋方向相反的电子之一自旋方向改变，以至电子自旋之和不为0的情况。处于第一电子激发态最低振动能级的分子，有可能通过无辐射跃迁(系间交连，intersystem crossing)消耗部分能量，其中一个电子的自旋方向倒转，从而处于三线态。从三线态的最低振动能级向基态的各振动能级跃迁并释放出光子，则其发光为磷光。由于三线态的电子自旋和不为零，这种跃迁是一种被禁跃迁，即跃迁几率很小。这样，在三线态停留的时间即寿命就比较长(从10-3秒到数秒)，强度很弱。由于三线态能量低于第一电子激发态最低振动能级，因此磷光的波长比荧光长。

4.2.3 激发谱和发射谱 (参考书P94)

荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率；发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。

激发谱既然是表示某种荧光物质在不同波长的激发光作用下所测得的同一波长下荧光强度的变化，而荧光的产生又与吸收有关，因此激发谱和吸收谱极为相似，呈正相关。

由于激发态和基态有相似的振动能级分布，而且从基态的最低振动能级跃迁到第一电子激发态各振动能级的几率与由第一电子激发态的最低振动能级跃迁到基态各振动能级的几率也相近，因此吸收谱与发射谱呈镜象对称关系。

Processes leading to fluorescence

***Figure 5.2***(p94)

在发射谱中最大荧光强度的位置称为max，它是荧光光谱的一个重要参数，对环境的极性和荧光团的运动很敏感。

4.2.4 荧光寿命(fluorescence lifetime) 参考书p95

去掉激发光后，分子的荧光强度降到激发时最大荧光强度的1/e所需要的时间，称为荧光寿命，常用表示:

I tI 0e-kt

其中I 0是激发时最大荧光强度，I t是时间t时的荧光强度，k是衰减常数。假定在时时测得的I t为I 0的1/e，则是我们定义的荧光寿命。

k1

1/k

即寿命是衰减常数k的倒数。事实上，在瞬间激发后的某个时间，荧光强度达到最大值，然后荧光强度将按指数规律下降。从最大荧光强度值后任一强度值下降到其1/e所需的时间都应等于。

如果激发态分子只以发射荧光的方式丢失能量，则荧光寿命与荧光发射的速率常数成反比，速率常数即为单位时间中发射的光子数，因此有F1/KF。KF是速率常 数。

F表示荧光分子的固有荧光寿命，kF表示荧光发射过程的衰减常数。如果除荧光发射外还有其它释放能量的过程(如淬灭和能量转移)，则寿命还和这些过程的速率常数有关，结果是荧光寿命降低。

由于吸收几率与发射几率有关， F与摩尔消光系数max (单位为cm2mol-1或

(mol dm--3) -1cm-1)也就密切相关，

从下式可以得到F的粗略估计值(单位为秒)。

1/F≈104max

在讨论寿命时，必须注意不要把寿命与跃迁时间混淆起来。跃迁时间是跃迁频率的倒数，而寿命是指分子在某种特定状态下存在的时间。

通过量测寿命，可以得到有关分子结构和动力学方面的信息。

4.2.5 量子产率 (quantum yield) 参考书P96

荧光量子产率是物质荧光特性中最基本的参数之一，它表示物质发射荧光的本领。

荧光量子产率通常用来表示，定义为发射量子数和吸收量子数之比，即由荧光发射造成的退激分子在全部退激分子中所占的比例，又称为荧光效率，即

发射量子数

吸收量子数

处于激发态的分子，除了通过发射荧光回到基态以外，还会通过一些其它过程回到基态。其结果是加快了激发态分子回到基态的过程(或称退激过程)。

总的退激过程的速率常数k可以用各种退激过程的速率常数之和来表示:

kkF+ki

ki表示各种非辐射过程的衰减速率常数。

则总的寿命为:

1/k1/(kF+ ki)

因此，量子产率又可以表示为

因为 1/kFF ， 1/(kF+ki)

所以 /F

的绝对值是较难用实验的方法测量的，因为必须事先知道仪器的修正因子。实际测量中大多采用相对法，即用已知量子产率的标准样品与待测样品进行比较。

后面将要证明:对稀溶液来说，荧光强度F与吸收度A成正比:

FkI0A

这里k是比例常数，I0是吸收前的光强度， 是荧光量子产率。

若两种溶液测量条件完全相同，则:

F1/F2A1 1/(A2 2)

1/ 2F1A2/(F2A1)

已知 2就可求出 1。

由于各种竞争性过程而使荧光量子产率减小的现象称为淬灭(quenching)，如温度淬灭，杂质淬灭等。量子产率对于生色团周围的环境以及各种淬灭过程很敏感。量子产率的改变必然会引起荧光强度的改变。因此，如果只要研究量子产率的相对值，只要量测荧光强度也就足够了。

4.2.6 荧光强度：参考书P97

荧光强度F取决于激发态的初始分布IA与量子产率的乘积。

这里的F指的是向各个方向上发射的荧光强度的总和，实际上，谱仪收集的只是其中的一小部分。因此仪器测到的荧光强度ＦIA Z，这里Z是仪器因子。

椐据Beer-Lambert定律

IAI0-ItI0{1-exp[-2.3 (A)·C·l]}

式中 (A)为激发波长处的消光系数，Ｃ为样品分子的浓度，I0为入射光强度，I0为透过样品后的光强度，l为光程（样品池光径）

对于稀溶液，吸收很稀， (A)很小

2.3 (A)C·l＜＜1

因此，1-2.3 (A)C·l≈exp(-2.3 (A)C·l)

IAI0(1-(1-2.3 (A)C·l)) 2.3I0 (A)C·l

Fλ=IAZ2.3I0 (A)C·l··Z

如果激发光强保持不变，且和Z与激发波长无关，则F (A)

很显然，荧光强度与样品在波度A处的消光系数有关，而消光系数与激发波长是密切相关的，消光系数随波长的变化即吸收谱，因此荧光强度也随激发波长的变化而变化。激发谱与吸收谱的正相关关系在此一目了然。

当然，实际上仪器因子Z与波长是有关的，这就使得激发谱与吸收谱并不完全相似。

4.2.7. 荧光偏振（偏振荧光，极化荧光） 参考书P98

用平面极化光（偏振光）去激发一个荧光系统，可以产生极化荧光。可以通过对极化荧荧光的分析确定分子的大小，形状和流动性等性质。因此极化荧光分析在生物研究中是一种有力的手段。

Figure T-format for polarization measurements. DET, detector; G, gain. Subscripts refer to horizontal (H), vertical (V), perpendicular() and parallel().

图 荧光偏振测量

如图所示，假设沿z轴振动的平面极化光由x轴入射原点，在原点有荧光分子，受其激发后此分子发射极化荧光，在y轴收集极化荧光，令I‖为沿ｚ轴振动的极化荧光，令I为沿ｘ轴振动的极化荧光。

定义极化率

P(I‖I)/(I‖+I) (IVV-IVH)/(IVV+IVH)

下标中的前，后两个字母分别表示入射光和发射光的偏振方向，V(vertical)表示垂直，H(horizontal)表示水平，如其中IVH是指入射光偏振方向为垂直而发射光为水平时测得的荧光强度，其它如IVV也依此类推。

荧光偏振是指物质在受激发时发射的荧光常为偏振光这样一种性质。从经典物理的观点来看，电子的跃迁相应于一个电偶极子的振动，其振动方向和电场变化方向一致时被激发发的几率最大，并随两者间夹角余弦的平方（COS2）而变化。电偶极子发射的荧光在与电偶极子方向垂直的方向上最强（即荧光传播方向与电偶极子方向垂直的荧光最强），在与电偶极子平行的方向上最弱。

溶液中的分子，其分布是随机的，而且从吸收到发射的时间之内，分子本身已经产生了转动，因此荧光偏振的程度将减小，所以荧光偏振又常称为荧光消偏振或荧光去偏振。

在分子朝向无规律但分子不能自由运动的溶液中，Ｐ的值称为本征极化率P0。如果分子在激发态的寿命期间有一定的运动，则Ｐ的值可能与P0不等。

定义不对称度(或荧光各向异性)

A(I‖I)/(I‖+2I)

(I‖+2I)表示发射光的全部，包括平行于入射光方向上的以及与入射光轴垂直的两个方向上的分量。

由于单色器和光电倍增管等对垂直和水平两个偏振成分的敏感度可能不同，因而严格的测定需要引入校正因子G，G为水平偏振光激发样品时，仪器对垂直偏振光的透射效率与对水平偏振光透射效率之比，定义为GIHV/IHH，IHV为起偏器水平取向而检偏器垂直取向时测得的荧光强度，IHH为起偏器和检偏器均为水平取向时测得的荧光强度。仪器不同，波长不同，Ｇ值都可能不同，应分别测定。

经校正后的荧光偏振度

Ｐ(IVVGIVH)/(IVV+GIVH)

经校正后的不对称度

A(IVVGIVH)/(IVV+2GIVH)

P和A的量测有时在稳态条件下进行，即采用恒定的光照。但有时也用毫微秒量级的偏振光脉冲来测量I‖和I的时间函数。这种技术常能测到一些其他的运动，是一种时间分辨的技术。

4.2.8 天然荧光生色团和荧光探针(Natural fluorophores and fluorescent probes)

参考书P99－102

生物化学中主要的荧光生色团可分为天然荧光生色团和荧光指示剂（荧光探针）两类。

天然的荧光生物分子只有芳香族氨基酸、核黄素、维生素A、叶绿素和NADH等少数分子，核酸中的碱基没有显著的荧光，只有tRNA中的Y碱基（二氢尿嘧啶）是个例外。在蛋白质的荧光谱中，由色氨酸残基发出的荧光占统治地位。

Table 5.1

总的来说，天然的荧光生物分子种类很有限，而且荧光强度较弱，为了研究多数的不发光的生物分子，人们广泛利用一类能产生稳定荧光的分子，把这些小分子和大分子结合起来，或者插入大分子中，根据这些较小的荧光分子性质的改变，分析大分子的结构，这类小分子称为荧光探针。对于作为荧光探针的分子有以下几个基本要求：

（1）能产生稳定的，较强的荧光。

（2）探针与被研究分子的某一微区必须有特异性的结合，而且结合得比较牢固。

（3）探针的荧光必须对环境条件较敏感。

（4）结合的探针不应影响被研究的大分子的结构和特性。

荧光探针种类很多。而且不断有人根据需要合成出新的探针。Campbell书图5.5列出了几种常用荧光探针的结构，书表5.2列举了一些典型的荧光探针的应用和基本性质（吸收波长，发射波长，灵敏度等）。

参考书图5.5

Table 5.2 Typical fluorescent probesa

参考书表5.2

4.3 环境对荧光参数的影响

荧光分析的主要特点是灵敏度高。一般来说，荧光分析的灵敏度要比吸收光谱测量高23个数量级。但正因为其灵敏度高，因此也容易受到各种因素的干扰。例如样品的温度度，pH值以及样品中杂质的存在等等。为了得到可靠的结果，实验设计和操作中需要考虑和设法减少这此因素的影响。在一定的场合，也可巧妙地利用荧光参数对环境困素的敏感性来达到我们的目的。

下面，我们将分别列举一些环境因素对max、 F和F等荧光参数的影响。

4.3.1 环境因素对max的影响 参考书P102

一般来说，处于第一电子激发态的分子，其电荷分布与它处于基态时是不同的。生色团与周围溶剂分子的相互作用可能会先于发射而发生，这种相互作用会改变激发态的能量及荧光发射的频率。引起每个电子能级中最低振动能级之间的吸收和发射跃迁（即0-0跃迁）的不平衡，并会破坏镜象关系。

4.3.1.1环境(如溶剂)的极性对max的影响

同一种荧光物质在不同极性的环境中，其max 可能会有所差别。一般来说，激发态的极性比基态要强，因此被激发的荧光分子将趋向于与极性溶剂（或极性环境）相互作用，使溶剂分子的电子分布会发生变化，偶极子重新取向，而这又会反过来影响荧光分子的基态和激发态能级，减少激发态的能量，引起发射谱的红移。例如(见Campbell书p103），当溶剂的极性由乙二醇、甲醇、异丙醇到辛醇依次减小时，ANS（1-氨基-8-萘磺酸酯，一种荧光探针，常用于与蛋白质非共价结合）的荧光谱发生兰移，量子产率提高。

Figure 5.6 The fluorescent spectra of l-anilino-8-naphthalene sulfonate (ANS) shifts toward the blue, and the quantum yield increases as the solvent polarity decreases in the order: ethylene glycol, methanol, n-propanol, and n-octanol

这种影响的结果可以用Lippert方程来解释：

＋常数

其中，a与f分别为荧光分子的吸收波数与发射波数，af 反映了吸收光与发射光能量的差别；为溶剂的介电常数；h为普朗克常数；c为光速，a为荧光分子在溶剂中所占空穴的半径，与分别为荧光分子处于基态和激发态时的偶极矩。由上式可见，折射率增加使能量差减少，而介电常数增加会使能量差增大。由于荧光分子激发态的偶极矩一般要大于基态偶极矩，荧光分子偶极矩的增大与溶剂分子相互作用，使溶剂分子的电子分布和偶极子取向发生变化。溶剂偶极子的重新取向需要比电子重新分布长得多的时间。介电常数不仅与偶极子取向有关，也与电子取向有关，上式中第一项()/(2)是电子和偶极子重新取向的结果；折射率n与电子重新分布有关，因此上式中第二项是电子重新分布的结果。

由于非极性溶剂分子没有偶极矩，因此没有在激发态荧光分子的作用下偶极子重新取向的问题，n2， af很小。而在极性溶剂中af 较大，产生红移。

(参考书P103例5.6)ANS在水中max 为515nm，与脱辅基肌红蛋白结合以后，max 移到454nm。ANS的max 兰移告诉我们，ANS与脱辅基肌红蛋白的结合部位可能在一个极性较小的疏水环境中。

实验事实还表明：ANS与脱辅基肌红蛋白的结合可以被血红素置换。这提示：ANS的结合是发生在血红素口袋（heme pocket）中或是其附近。这样可以进一步推测：血红素口袋附近也是（极性较小的）疏水环境。

上面提到的“环境极性加强，max红移”的规律，并不是绝对的。例如，如果在激发态的寿命之内，分子没有足够的时间来重新排列并降低激发态的能量，则可能发生max兰移的情况。这种现象称为“orientation constraint”(参考书P103)。这说明在利用max作为环境极性的探针时要十分谨慎。

4.3.1.2 pH值对max的影响：

如果荧光物质为弱酸或弱碱，则溶液pH值的改变常对max有影响。这是因为弱酸和弱碱分子和其离子在电子结构上有所不同，因而荧光max也可能发生变化。例如，1-萘胺-5-磺酸在不同pH值时，会以两种不同离子的形式存在，这两种离子的荧光波长是不同的。利用这种效应，可以将其荧光波长作为pH值的指示剂。

4.3.1.3 溶液粘度对max的影响

溶液粘度有时也会对max有影响，例如TNS在蔗糖水溶液中的max会随蔗糖浓度的变化而变化。当蔗糖浓度由10%增加到60%，粘度从1.3分泊增加到58分泊，max以580nm兰移到555nm。

4.3.1.4共振能量转移对max的影响(参考书P113－114)

如果两种生色团荧光频率接近，则当两种基团足够接近时，用一种生色团能吸收的光激发使之处于激发态后，处于激发态的这种生色团可能将激发能转移到另一种生色团，使第二种生色团进入激发态，产生第二种生色团特有的荧光，这种现象称为共振能量转移。显然，共振能量转移对max可能造成影响。

4.3.2 环境对荧光量子产率F和荧光强度的影响(参考书P103－106)

由于稀溶液中荧光强度FKI0A F ，（这里I0是激发光强度，A是光密度或吸收度， 0是荧光量子产率，K为常数）因此凡是会影响荧光量子产率F的环境因素也必然会影响荧光强度。

4.3.2.1溶剂（或环境）极性的影响

量子产率（荧光强度）会随着溶剂（或环境）极性的减小而增加。这一点前面已经提到过。一种可能的机制是：在非极性的溶剂中系间交连（转移到另外的激发态）的速率会减少。

4.3.2.2光化分解

荧光物质因吸收光能而造成某一键断裂的现象称为光化分解（photodissociation），光化分解会造成荧光逐渐减弱。尤其是对于稀溶液来说，光化分解就更为严重。通常，为减少光化分解现象造成的影响，可采取以下措施：

. 减少光照时间和强度：例如，保存在深色瓶中，或用黑纸、铝箔等好，测量时使用较弱的光源等。如果样品激发谱有一个以上的激发峰，一般采用激发波长最长的激发光，以减少样品的光化分解。样品放到样品架上后要尽快测量，不测时应立即关上光闸。

. 由于稀溶液更容易变质，而样品在浓溶液中要稳定一些，因此储备液要配得浓一些，使用前再稀释。

. 仪器本身的改进如提高检测器灵敏度，降低光源强度等，也有利于减少光化分解。

4.3.2.3 温度对荧光强度的影响

一般来说，溶液的荧光强度随温度的降低而增强，温度的升向与荧光强度的减弱在一定范围内是线性关系。温度每升高1C，荧光减弱的百分数称为温度系数。一般荧光物质的温度系数大约为1%，但有些荧光物质可大到5%。

温度升高，荧光强度减弱的原因主要是溶液的粘度减小，溶剂与溶质分子的动能增加，使得荧光分子的其它分子之间的碰撞几率增加，激发态荧光分子通过分子间碰撞或分子内能量的转移，将自己的能量转移出去。以非荧光发射的形式回到基态，这就造成荧光淬灭，量子产率降低的情况。如果溶液中有淬灭剂存在，则淬灭剂的作用也会随温度升高而增大。

为减少温度对荧光强度的影响，可采用恒温样品架维持样品温度的恒定。

4.3.2.4 样品浓度对荧光强度的影响：

在样品浓度较低时，荧光强度与荧光物质的浓度成正比。但到了一定浓度以后，就不再存在这种正比关系。这是因为：

I. 荧光强度FKI0(1elc)，这里K是仪器常数，是量子产率，I0是激发光强度，是克分子消光系数，l是样品池光径，C是样品浓度。浓度增加到一定程度后，接近0，浓度继续增加，荧光强度不再增加。只有样品浓度很稀时，

FKI0 [1(1lc)]KI0lC

. 荧光浓度过大时，常常发生淬灭现象。这样就使荧光强度反而大大低于接近饱和时的荧光强度。

淬灭产生的原因至今仍众说纷纭，最简单的解释是：单线能级的激发分子在发出荧光之前就和未激发的荧光物质分子碰撞而自淬灭。

. 浓度过高，可能形成样品分的二聚体或多聚体。因而降低荧光强度。

. 产生浓度淬灭的重要原因之一是荧光分子在样品池中分布均匀：当溶液较稀时，均匀分布在样品池中的荧光收强烈，越进入溶液，发荧光分子越少，因而大量的激发光在到达池内之前就被吸收了。这样，从垂直于激发光方向的角度来接收荧光，检测到的荧光就很微弱了。即使是在靠近入射光的面上，也只有靠近检测器的面上荧光容易被接收到。离探测器较远的荧光分发出的荧光又会被瓣面的荧光分子吸收（如果物质本身的吸收光谱和发射光谱有重叠的话），即大部分荧光发射在离开吸收池前就又被吸收。

解决浓度淬灭的办法之一，是将样品尽量稀释到荧光强度与荧光染料宵度成范围线性关系的深浓度来测量。浓度淬灭的现象有时也可以加以利用，例如在脂质体里包裹高浓度的荧光染料，由于浓度淬灭，包裹在脂质体内的荧光染料荧光强度很低。一旦荧光染料从脂质体内泄漏出来，由于荧光染料浓度下降，进入线性区，因此荧光强度大大增加。

4.3.2.5杂质对量子产率（荧光强度）的影响

除荧光分子之外的其它分子与荧光分子的相互作用使荧光量子产率减少的现象统称为杂质淬灭。

会引起荧光淬来的物质称为淬灭剂。例如中性的0.1M磷酸缓冲液能淬灭酪氨酸的荧光。

杂质淬灭的形式大致有以下几种：

Ⅰ. 碰撞淬灭：溶液中荧光分子与淬灭剂分子碰撞，荧光分子损失能量而导致量子产率减少，荧光强度降低。

Ⅱ. 组成化合物导致荧光淬灭：一部分荧光分子与淬灭剂分子作用而形成络合物。这种络合物本身可能不发荧光，也可能会具有吸收激发光能或荧光物质所发射的荧光光能的能力，从而减少观察到的荧光（内滤光效应）。

Ⅲ. 含溴、含碘化合物、硝基化合物、重氮化合物、 基化合物、 基化合物及某些杂 化合物容易由单线态转变至三线态。转入三线态的分子在常温下不发光，它们把多余的能量消耗在与其它分子的碰撞中，引起荧光淬灭。只有在低温下，由三线态返回基态而放出波长的磷光。

Ⅳ. 发生电子转移反应的淬灭。

某些淬灭剂分子与荧光物质分子相互作用时，发生了电子能移反应，即氧化还原反应。因而引起荧光淬灭。甲基兰荧光溶液被Fe2淬灭便是一个例子。发生电子转移反应的淬灭剂并不限于金属离子。I、Br 、CNs等易于给出电子的阴离子对奎宁，罗丹明及荧光素钠等有机荧不物质也会发生淬灭作用。

Ⅴ. 共振能量转移：（略）

引起淬灭的一种最常见的物质是大气氧。氧分子对荧光物质产生淬灭的原因可能主要是由于O2在基态就是一种三线态，它在和单线态的荧光分子相互作用时会形成单线态的氧分子和三线态的荧光分子。氧在弱极性溶剂中的溶解度比较高，例如氧在乙烷中的溶解度约为在水中的几倍。因此必须通氮赶氧，克服这种淬灭。

总的来说，为克服杂质淬灭带来的问题，对所使用的溶剂或缓冲液，首先要考虑其对所使用的荧光物质是否有直接作用。另外必须考虑溶剂的纯度。此外如洗液中的重铬酸钾，其两个吸收峰恰好在色氨酸的激发和发射峰附近。吸收了色氨酸的激发能及其发射的荧光（内滤光效应）因此荧光器皿不能用洗液来洗。

荧光淬灭剂有时也可以加以利用，例如可以利用某种淬灭剂对荧光物质的淬灭作用来进行定量分析。例如，利用氧分子对硼酸根一二 乙醇酮络合物的荧光淬灭效应，可以作微量氧的测定。由于淬灭作用是特异性的，因此用这种方法有时比直接测定法灵敏度更高，选择性更强。

4.3.2.6 pH值对量子产率和荧光强度的影响

如荧光物质为弱酸或弱碱，则溶液pH值的改变常对荧光强度有较大影响。利用这些物质对pH值的敏感性，可以将它们用作pH指示剂，或利用它们在不同pH值溶液中荧光强度的改变来判断酸碱滴定的络点（特别是在有色或混浊的溶液中）。

4.3.2.7溶液粘度对荧光强度的影响

荧光强度一般随介质粘度的升高而增强。因为介质粘度增加，减少了分子碰撞，从而减少了能量损失。例如荧光物质NTS在不同浓度的蔗糖水溶液中，荧光强度随粘度增加而增加。

（郭书p111图5.6）

4.3.2.8膜电位的影响

有些能和膜结合的荧光分子的荧光强度会随着膜电位的改变而改变，这种变化有的是由于带电的荧光染料随膜电位变化而在膜内外重新分布。有的是由于荧光分子的荧光谱在电场下发生改变（电生色性， electro chronism）。按照对膜电位变化的反应速度，大小和光学信号改变的机制，这类电位敏感的荧光染料又可以分为慢反应染料和快反应染料。

这种现象可以用来监测膜电位的变化。

4.3.2.9其它各种干扰因素

还有一些其它的干扰因素可能影响荧光强度，例如光散射就可能影响荧光强度。区分散射光和荧光发射的依据，是散射光与激发光波长相同，离荧光峰较远。荧光污染也是影响荧光强度的一种因素。例如洗涤器皿的合成去污剂常能产生很强的荧光，分液偏斗上涂的润滑油也有很强的荧光。另外，溶液中微生物的产生，滤纸中的杂质，也都有可能造成荧光污染。另外，表面吸咐也会对稀溶液的荧光测定造成影。

4.3.3 环境因素对荧光寿命的影响

4.3.3.1碰撞淬灭

前面曾提到碰撞淬灭会降低荧光强度，碰撞淬灭也可能使荧光寿命缩短。例如前面提到的0.1M磷酸缓冲液，能使酪氨酸的荧光寿命从3.4ns缩短到2.6ns。

4.3.3.2浓度与荧光寿命的关系

一些荧光染料的荧光寿命随浓度的增加而延长。这种现象不是由于二聚体的形成，而是由于自吸收。特别是当吸收光谱与荧光光谱有较大重叠时，重叠区的荧光发射后，再一次被吸收，经历了二次激发或多次激发，测量到的表观寿命就会延长。

4.3.3.3 分子内环境与荧光寿命

生色团在分子内的环境也会影响荧光寿命，正是由于这个原因，荧光寿命才被用来分析分子内不同的生色团所处的环境。当然，严格地说，分子内环境和外环境是两个不同的概念。

除上述可能影响荧光寿命的因素之外，实际中要注意的是，不同测量方法测出的寿命也会有一定差别。因此研究荧光寿命时，相同方法测量出来的寿命才有可比性。

4.3.4 环境对荧光偏振度的影响

4.3.4.1温度对荧光偏振度P的影响

（1）温度对荧光偏振度P的影响：一般来说，温度升高，荧光偏振度会下降。

4.3.4.2 粘度对荧光偏振度的影响

随着粘度的提高，荧光偏振度也会上升。

4.4 仪器原理及结构：

荧光谱仪结构上的最主要特点是入射的激发光与荧光探测方向垂直。如图 所示。

图 是M850型荧光光谱仪的结构框图。仪器主要组成部分如下：

1. 光源：此处光源为氙灯，氙灯在200-800nm范围内具较好的发射谱。汞灯是为校准用的。

2. 入射光单色器：入射光单色器是用来选择特定波长的单色光，入射到样品上。荧光分光度计中采用光栅作为单色器。激发波长择描就是靠它来改变波长。

3. 监视探测器：这个探测器用来监测光源的恒定性。

4. 光闸：光闸关闭时，入射光被挡住，不能照到样品上，这样可以防止样品长期受到照射而产生化分解。另外，在打开样品室的盖时，关上光闸，可以防止读数过大，给图笔撞击端部。

5. 样品杯：样品杯是10mm×10mm的石英杯，四面透明，且用去荧光石英材料制成。注意荧光样品杯不能用紫外谱仪中的样品杯代替。

6. 发射光单色器：用来选择一定波长的光进入探测器测量。发射光择描就是用它来实现的。

7. 计算机辅助记录系统：用以完成绘图及荧光强度的测量。

图 M850型荧光光谱仪结构示意框图。

B. Instrument Configurations for Conventional Fluorescence Measurements

Instruments designed for luminescence spectroscopy can usually be used for either fluorescence or phosphorescence measurements with a few instrumental modifications generally required for the latter. In this section we will discuss the instrumental configurations used for fluorescence instruments. Subsequent sections will address the specific instrumental requirements and some of the special techniques required for phosphorescence measurements.

Figure 7. Schematic diagram of a double-beam (ratiometric) filter fluorometer. From Sequoia-Turner, with permission.

Figure 8. Schematic diagram of a single-beam spectrofluorometer. From Perkin-Elmer, with permission.

1. Filter Fluorometers.

Instruments in which wavelength selection is accomplished with filters are generally referred to as fluorometers, whereas monochromator-based instruments

capable of spectral scanning are called spectrofluorometers. The simplest, least expensive, fluorometers are single beam filter instruments with halogen lamp sources, phototube or PMT detectors and simple output devices. Ratiometric fluorometers are also available in which the ratio of the sample signal to a reference signal is used in order to compensate for fluctuations in fine voltage, drift, etc. In some instruments, such as the one shown in Figure 7, the sample and reference light paths are taken from the same source and alternately measured by the same detector through the use of a mechanical cam. A similar configuration in which two detectors are used, one for the sample beam and one for the reference beam, will correct for source output fluctuations only. Single detector configurations are also possible to minimize effects of detector variability.

Filter fluorometers are suitable for quantitative analysis applications in which spectral scanning and high resolution are not required. Filters transmit more light and cost less than monochromators, thereby providing better detection limits with less expensive instrumentation.

2. Spectrofluorometers.

Figure 9. Schematic diagram of a ratiometric spectrofluorometcr. From PerkinElmer, with permission.

Spectrofluorometers are also available in both single beam and ratiometric configurations. A single beam instrument is shown in Figure 8. A ratiometric spectrofluorometcr configuration in which two separate detectors are employed is depicted in Figure 9. The reference PMT monitors the excitation beam after it has passed through the monochromator so that corrections are based on fluctuations in thc wavelength of interest only. The reference PMT is placed after the sample to monitor the transmitted beam, thereby allowing absorption measurements to be made on the sample.

Figure 10. Depiction of single photon counting. The signal is detected by the PMT, emerging as a pulse which is then amplified. If the magnitude of the amplified pulse exceeds a certain threshold, it is passed through the discriminator and counted as a signal. Smaller pulses due to noise and dark current are much more likely to be rejected, thereby increasing signal-to-noise. From J.D. Ingle, Jr. and S.R. Crouch, Eds., Spectrochemical Analysis, Prentice Hall, (1988), with permission.

Single photon counting instruments are used to measure very low light levels and are designed for maximum signal-to-noise performance. Figure 10 illustrates the single-photon counting detection scheme. Double monochromator arrangements are often used in the excitation or emission beams of single photon counting instruments to minimize stray light. Cooled PMT housings may be useful to minimize detector noise. Effects of fluctuations in source output can be minimized by ratiometric detection, in which a reference PMT detects a portion of the excitation beam that is diverted to the detector by a beam sputter placed between the excitation monochromator and the sample. If an appropriate blank solution is placed in the reference beam, absorption measurements can also be made.

Spectrofluorometers offer the most flexibility for quantitative and qualitative applications. Many instruments are modular so that monochromators can be replaced with filters in the emission or excitation beams if desired.

4.5荧光分析在生物学中的应用

荧光分析应用的范围很广。生物学和医学的各个学科，包括生理、生化、生物物理、药理、免疫、细胞、遗传等，都可以使用这一技术。从研究的材料来看、氨基酸、蛋白质核酸、维生素酶、药物、毒物等都可以采用。我们不准备系统介绍荧光技术在各方面的应用，只想就内源荧光和外源荧光在生物学、医学中应用的可能性，举一些例子。

4.5.1内源荧光的探测和应用

生物学中比较重要的天然荧光分子多属具有共轮双键的系统。如芳香氨基酸、核黄素、维生素A、卟啉、叶绿素、NADH和tRNA中的Y碱基（二氢尿嘧啶）等。对于含有这些天然荧光物质的样品，可以直接通达量测其荧光来确定其存在，分布及数量。

4.5.1.1蛋白质的内源荧光

利用蛋白质的内源荧光蛋白，其灵敏度高于紫外吸收法，而且没有可检测的荧光。蛋白质的荧光来自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。它们的相对荧光强度为100:9:0.5。检测蛋白质的天然荧光，可采用280nm的激发波长，发射波长范围在340-350（蛋白溶液为中性时）。如果蛋白中不含色氨酸，只含苯丙氨酸和酪氨酸，则荧光光谱主要表现酪氨酸的特征，最大发射波长约为304nm。对于含有色氨酸的蛋白，荧光光谱则主要表现色氨酸的特征，最大荧光发射在320-350nm之间。

利用蛋白质的天然荧光，可以检测蛋白质的含量。例如用荧光检测牛奶中的蛋白质含量，就是一种既快又准确的方法。

利用蛋白质的内源荧光，还可以分析蛋白质结构的变化。

4.1.2维生素的内源荧光分析：

由于维生素大多会有芳香环结构，本身具有较强的天然荧光，因此可以利用内源荧光检测维生素。例如，可用345nm激发，490nm处测量，用以确定血液中维生素A的含量。核黄素即维生素B2在pH7.0时，用激发波长370nm（或440nm），发射波长为565nm检测，可以确定组织中核黄素的总量。维生素B12在pH7的溶液中，可以用275nm激发，305nm处检测。维生素C用490nm激发，可产生绿色荧光（530nm）。

4.2 外源荧光的应用：

由于天然荧光分子种类有限，在生物学和医学的实际中，应用得更加广泛的是荧光探针，即外源荧光技术。目前，荧光探针的种类已经有上千种，人们可以根据所研究问题的不同，选择不同的荧光探针。下面我们将介绍几个荧光探针应用的例子。

4.2.1蛋白质的荧光标记：

有些荧光探针可以与蛋白质上特定的基团共价结合，例如胺基(amine)和巯基(thiol)就是蛋白质中容易结合的两种基团。例如：卤代乙酰类衍生物(haloacetyl derivatives)顺丁烯二酰亚胺(maleimides)及其它一些巯基反应剂，可以和巯基共价结合；异硫氰酸盐(isothiocyanates)，琥伯酰亚胺酯(succinimidyl esters)，羧酸(carboxylic acid)，磺酰氯(sulfonyl chloride)等，可以和氨基共价结合；等等。另外有一些荧光探针可以和蛋白质非共价结合。例如：1，8-ANS和2，6-TNS， DNS等，在水中基本不发荧光，但当结合到一些蛋白质上时，可以发出很强的荧光。利用蛋白质的荧光标记方法，可以研究荧光探针标记的部位微环境的极性、结构、分子运动、结合紧密程度等。也可以利用共振能量转移原理测定基团之间的距离等。

4.2.1.1 利用荧光探针研究蛋白结合部位的极性：

前面曾提到过ANS荧光谱会随着所处环境特性的增加而发生兰移(参考书P103)，且量子产率也随之提高。利用ANS的这个性质，可以衡量ANS标记部位的极性大小。根据极性大小，又可以进一步推测蛋白质结构的变化。

4.2.1.2利用荧光探针研究蛋白质结构的变化：

由于荧光探针的荧光谱对环境变化十分敏感，因此它对蛋白质分子的构象变化也就十分敏感。利用荧光探针研究了许多酶的变化效应。例如用DNS-Cl标记DNS-GDH（GDH 谷氨酸脱氢酶）在有辅酶存在时的荧光光谱与没有辅酶时相比，有明显变化，表明辅酶的存在会引起GDH构象的变化。

外源荧光团标记到蛋白质上以后，也可以通过荧光偏振来检测蛋白质构象的变化。

4.2.1.3分子运动量测：

处于激发态的分子在发射荧光前的寿命是有限的。大约为10-9秒。任何发生在这个时间量级内的分子的运动。例如翻滚碰撞，都会引起荧光观测值的变化。通过分析这种变化，就可以得到有关分子动力学的信息。例如从荧光寿命和荧光强度的变化情况，可以估算出由于淬灭物的存在而引起的荧光淬灭的速率常数，进而估算出淬灭物的扩散系数D。

研究分子运动情况时常常利用的又一个荧光参数是荧光偏振或荧光消偏振(参考书P110)。荧光偏振的定义我们在前面已经介绍过。由于荧光偏振和分子的运动，温度及介质的粘度等有关。因此荧光偏振常用来研粉生物大分了的运动。Perrin公式表示了荧光偏振度P与荧光寿命，旋转弛豫时间。粘滞系数和分子体积V0的关系：

1/P 1/3=(1/P0 1/3)(1+3/)=(1/P0 1/3)(1+RT/ V0)

( 用自然光激发时上式中用正号，用偏振光激发时用负号)

这里R为气体常数，T为绝对温度，P0为固有偏振或极限偏振度（即粘度极大，温度极低时的P值），旋转弛豫时间定义为分子转动一个角度，其余弦降为e1所需的时间，可以用来衡量分子转动的快度。

4.2.1.4 利用荧光探针研究生物分子的结合程度：

在生物学中，抗体和抗原，酶和底物，药物与受体等分子间的结合，是研究生物活性的重要内容。生物分子结合时，标记在其中的荧光探针的荧光参数会随之改变。通过这些参数的变化，就可了解它们结合的牢固程度，例如，结合得牢固的分子，结合后的复合物弛豫时间长，荧光偏振也就大。如果结合得较为松散，则复合物的弛豫时间短，荧光偏振就小。例如，用荧光探针标记的抗原与抗体反应，由于抗原-抗体复合物的迁移率小于原来的迁移率，因此荧光偏振就增加。利用这种办法，可以检测免疫反应的发生与否。并进一步研究免疫反应的机制。在底物与酶结合时，荧光标记的底物由于与酶的结合迁移率减小，偏振度增加。因此，可以由荧光偏振度的变化来求得结合常数。

4.2.1.5 共振能量转移测量生色团之间的距离光谱尺(参考书P113－119)：

如果两种不同的荧光生色团离得较近，且其中一种生色团的荧光发射谱与另一种生色团的激发谱有相当程度的重叠。则当第一种荧光团被激发时，另一种荧光团却因第一种生色团激发能的转移而被激发，这种现象称为共振能量转移。转移效率T与两种生色团之间的距离R有下列关系：

R06

T=

R6 +R06

转移效率T=1T/D

T和D 分别表示存在和不存在共振能量转移时供体的量子产率。

这里R0称为临界距离，定义为能量转移效率为50%时两个生色团之间的距离，对于每个供体一受体时，R0是常数。R0可以根据受体的吸收谱和供体的发射谱， 介质的折射系数。供体和受体跃迁电偶极矩的朝向因子。供体在没有受体存在时的量子产率等参数估算出来（这里不详细介绍）。根据Ｔ和R0，即可求出两个生色团之间的距离。这种测定生色团距离的方法，常被人称为光谱尺。

转移效率T也可以用其它方式估算出来：

SA

T

s-1+SA

S：敏化剂， A：受体

SA：共振能量转移的速率常数，S：敏化剂不转移能量时供体的寿命； s-1： 敏化剂不转移能量时供体的速率常数。

4.2.2核酸的荧光标记：

由于碱基和核酸量子产率很低，因此常常需要利用荧光探针来标记核酸，达到检测核酸的目的。有一类荧光探针可以透膜，因此这类探针既可用于活细胞核的荧光染料，又可作为固定后的细胞核的染色。另一类荧光探剂不能透膜，这类探剂可以用来标记固一细胞的核，也可用来鉴定死亡细胞。现在还有一类可用来标记核酸的荧光染料，其灵敏度可高达pg(皮克)量级DNA的检测。

4.2.2.1 可透过细胞膜的核酸染料。

4.2.2.1.1 吖啶橙（Acridine Orange， AO）

吖啶橙通过嵌入（nitercalation）或静电吸引力与DNA和RNA相互作用。但在浓缩的染色质中，DNA堆积在一起，使AO无法嵌入（插入），在与DNA相结合时，这种染料的荧光谱与荧光素（Fluorescein ）很相似，其发射谱峰值在525nm，而在与RNA相结合时，发射峰红移至650nm。AO在很多病的诊断，分类和预后中用来量测单股和双股的DNA和RNA。AO是一种应用得很广泛的荧光探剂。

AO应用的例子有凝胶电泳中DNA构型变化的研究。活胰岛细胞中含胰岛素的分泌粒的染色，用图象分析的方法进行大肠杆菌计数和疟疾的快速诊断等等。AO还可以作为细胞内pH梯度的通用指示剂，可用来监测Na-质子交换，量测质子泵的活性等。

4.2.2.1.2二联苯亚胺(bisbenzimide):这是一种体外活性的，与DNA小沟(minor groove)结合的染料，它可透过细胞膜，毒性较小，溶于水(2%)。它可用氩激光器的紫外光及大多数的荧光激发光源来激发。由于其激发波长(345nm)和发射波长(460nm)间有一个较大的Stockes频移，因此比较适于与其它紫外光激发的荧光染料一起作多重荧光标记。这类染料与DNA结合后，荧光强度大大提高。这类染料与DNA结合时，特别易于与连续的AT碱基对结合，它与多聚-[d(A-T)]序列结合力特别强，可以置换一些其它的DNA嵌入物(intercalator)。其荧光强度和结合的亲合力也与DNA序列的碱基组成及构象密切相关。这类染料中的Hoechst 33342在BrdU (5-bromideoxyuridine， 5-溴脱氧尿苷)插入DNA的位点上发生荧光淬灭的现象，因此可用来确定BrdU处理过的活细胞的增殖状态。但Hoechst在与BrdU一起使用时，可能有某种程度的光毒性(phototoxic)。

Hoechst染料还可以在琼脂糖凝胶中存在RNA的情况下检测DNA，也可用来确定细胞数量，进行染色体分类，进行多变量分析等，还可用在过量单股引物存在时确定PCR的产物产率。Hoechst曾用于鉴别DNA构象中发卡区的平行和反平行结构。

4.2.2.1.3 DAPI （4’，6-diamidino-2-phenylinodule)

这种染料可以用汞弧灯或氩离子激光的紫外光来激发。这种蓝色的荧光染料结合在双股DNA的小沟上，特别容易和AT碱基团相结合，其荧光寿命分布曾用于确定结合位点的不均匀性。DAPI与双股DNA结合时，其荧光强度增加20倍左右，这是由于DAPI和小沟处的水分子都被置换。DAPI与单股DNA结合时荧光强度一般不会增加。DAPI的荧光在它与葡聚糖磷酸盐、SDS、多磷酸盐其它多聚阴离子(Polyanion)相结合时也会增加。DAPI还可与肌质网、微管蛋白和微管相结合。DAPI有较强的消光系数，是荧光最强的DNA染料之一。虽然Hoechst染料荧光可能更强一些，但其光稳定性不如DAPI。DAPI在琼脂中检测双股DNA灵敏度要明显高于溴化乙锭(EB)，在RNA存在的条件下对DNA的选择性也高于EB等染料。

4.2.2.2 不能透过细胞膜的单体核酸染料

4.2.2.2.1 溴化乙锭(EB)和PI （Propidium Iodine)

PI 比EB水溶性高，透膜能力低于EB，这两种染料一般都不能进入活细胞。这两种染料都可以用氩激光器或汞灯、氙灯来激发，可用于细胞计数、荧光显微镜、荧光分光光度计等。这两种染料对于碱基对基本上没有选择性，但EB－DNA复合物受激发时可能会产生荧光染料的光淬灭。EB和PI都可以于RNA结合，要区别RNA和DNA，需要用核酸酶来处理。一旦与核酸结合，其荧光会增强，激发峰红移30－40nm，发射峰兰移15nm左右。

EB是一种在凝胶中常用的DNA检测剂，它可以与单股、双股和三股DNA相结合。EB可以在很多场合下检测DNA。例如，包裹在脂质体中的EB荧光教低，当脂质体与细胞融合时，或是DNA与脂质体结合时，荧光会增强。这就提供了一种跟踪脂质体-细胞融合的手段。PI的应用与EB类似，它常用于检测死细胞或正在死亡的细胞。

4.2.2.2.2 PRO

这是一种新的不透膜的核酸染料，性质十分独特。其消光系数高于PI，未与核酸结合时，荧光强度几乎为0。它与双股DNA的亲和力很高，但与RNA和单股DNA也可结合，但荧光强度教低。它既可在溶液中也可在细胞中计量DNA。这组染料无法透过活细胞膜，可用于检测膜的完整性。

4.2.2.2.3 超灵敏二聚体核酸染料

如果设计得当，二聚体染料嵌入DNA的亲和性会比单体染料高几个数量级。例如，某些二聚体染料的灵敏度可达pg量级的DNA。

4.2.3 生物膜的荧光标记

荧光探针可用来研究生物膜的结构和动力学，也可用来研究脂的输运和代谢。下图给出了一些荧光探针与膜结合位点的示意图。

Location and orientation of representative fluorescent membrane probes in a phospholipid bilayer.

A) DPH, B) C6-NBD-PC, C) bis-pyrene-PC, D) DiI, E) anthroloxy-FA, G) NBD-PE, H) DiA

（Molecular probes, P235 Fig VIa)

4.2.3.1 用荧光探针研究膜的结构

生物膜中各种脂的分布是非均一的，利用光漂白恢复技术(photobleaching recovery techniques)或荧光显微镜直接观察，可以根据膜流动性的特点将膜横向（lateral)划分为分立的域(domain)。磷脂烃链或头部的差别可以造成这种横向分域现象，蛋白质的作用或与阴离子的相互作用也可这种情况。从横截面(transverse)来看，脂双层的结构也是不对称的。此外，磷脂还可能形成一些非双层结构，例如六角相或管状(tubule)结构。非双层结构在膜融合中起重要作用。这种结构可以用荧光探针很方便地鉴定。整合蛋白及其它的脂，特别是胆固醇，也是生物膜的重要成分。通过与蛋白质连接的生色团(包括色氨酸残基的内源荧光生色团)向两性脂分子荧光探针的非辐射能量转移，可以得到有关整合膜蛋白的结构信息。

4.2.3.2 用荧光探针研究膜的动力学

膜的动力学包括膜内部的分子运动和膜的平动。利用荧光漂白恢复技术，已对膜平面方向上的脂横向扩散运动进行了充分研究。脂在二维平面上的扩散系数大约为10-8cm2s-1。横向扩散系数也可以通过其它的双分子过程如荧光淬灭、激发态原子或分子(excimer)形成、光二聚化(photodimerization)等过程的速率常数来测定。但这些方法得到的扩散系数往往偏高，这可能是由于静态(static， i.e. non-diffusion-controlled)相互作用。

磷脂的自发性跨膜运动(flip-flop， 翻跟斗)则是比横向扩散慢得多的运动过程，其典型的时间尺度是数小时。磷脂的跨膜运动可以用非辐射性能量转移技术来检测，也可以用芘(pyrene)荧光激发态原子荧光(exciemr fluorescence)技术来研究。

磷脂内部的烃链运动研究广泛采用了荧光技术，特别是荧光偏振或不对称性量测技术。使用的荧光探针有DPH、十八碳四烯酸(parinaric acid，姜饼树酸)、anthroyloxy等，这些探针常被称为膜流动性指示剂。其实，它们大部分只对脂的烃链角度取向变化敏感，而这种运动不一定与膜平面方向的横向扩散过程有关。时间分辨的量测也说明：这些荧光染料的荧光非对称性主要取决于这种运动的角度范围，而不取决于其运动速率。

4.2.3.3 用荧光探针研究膜融合和膜通透性

膜融合是很多重要的生物过程包括内吞、分泌转运、和病毒感染过程的重要组成部分。在研究膜融合的荧光技术中，融合引起的荧光变化与荧光生色团靠近的程度有关，例如非辐射性能量转移过程、形成芘荧光激发子的过程和荧光淬灭的过程。荧光检测融合，既可检测膜脂的混合，也可检测参与膜融合的膜液态内含物。利用亲脂的DiI和亲水钙黄素(Calcein)两种荧光染料作为探针，加上双波长荧光显微和摄像技术，可以同时适时监测膜融合时膜脂和膜内含液体物质的混合过程。ANTS、Calcein、CF (carboxyfluorescein)等，都可以用来研究膜通透性和融合。

4.2.3.4 用荧光探针研究膜脂转运

荧光膜探针越来越多地用于研究细胞内和细胞外的脂转运、脂合成和脂的分解，特别是研究脂被脂酶分解的过程。这些过程不仅涉及脂的代谢途径，而且在细胞信号传递中起整合的作用。脂的转移有时通过蛋白质作为中介，有时则是自发的。烃链较短的磷脂在水溶液中的溶解性较高，因此比较容易进行脂的直接转运。

无论是自发的还是由中介物介导的脂转运，都可以用荧光显微镜直接监测，也可以通过与观测融合过程的方法类似的方法来间接观察，例如将自淬灭的荧光生色团稀释，荧光能量转移，芘荧光激发子的形成等。

4.2.3.5 用荧光探针研究膜与外来各种物质的相互作用

很多物质可以与膜作用而产生膜结构的多形性及膜动力学参数的变化。例如，钙离子会引起膜的横向相分离，还会引起含酸性磷脂的膜的融合。药物、麻醉剂、某些两性分子及一些外在蛋白都可能改变和调节膜的动力学性质。这些作用可以用DPH、其衍生物TMA-DPH和TMAP-DPH和anthroyloxystearates来检测。

利用全内反射荧光显微镜技术（total internal reflection fluorescence microscopy)对受体-配基的相互作用有了更深入的了解。采用这种技术，可以对靠近玻璃和溶液界面上的生色团作选择性的激发，从而对受体与荧光抗体之间的相互作用进行研究。这种技术对于细胞表面的接触(细胞粘连)的直接观察特别有用。在这种实验中，亲脂的羰花青(carbocyanine)一类荧光探针(例如DiI)常用来标记细胞膜。

4.2.4 用荧光探针量测膜电位

荧光探针常用来量测膜电位的变化，特别是当细胞器或细胞太小，无法使用微电极时，或是要同时监测膜上多个点的电位变化时，电位敏感的荧光探针方法的优势更是其它方法难于比拟的。

目前常用的膜电位荧光探针包括带正电的羰花青(carbocyanine)，带负电的oxonol，部花青(merocyanine)，merocyanine-oxonol及两性或带正电的styryl(苯乙烯基)染料等。其结构式如下:

林书P81图

根据对膜电位的反应速度，膜荧光探针还可分为快反应染料(Probes with fast response time)和慢反应染料(probes with slow resoponse time)。快反应染料的荧光强度变化是由于荧光生色团内部电荷分布随膜电位的变化而直接变化。而慢反应染料则是由于荧光探针分子在膜上的分布随膜电位而变化的结果。

不同种类的膜荧光探针不仅对膜电位变化的反应速度和机制不同，而且在膜内的积累和对细胞的毒性也不同。然而，要对电位敏感的荧光染料进行标定常常是很困难的。因为有些染料会与药物或离子载体发生作用，引起光损伤或引起与电位无关的谱变化。

下表列举了一些膜电位敏感荧光染料及其应用的例子。

4.2.5 金属代谢的荧光监测

由于钙，钾，钠，镁，锌等金属及其代谢在细胞活动中起着重要的作用，因此活体监测这些金属的代谢具有重要的意义。现在已经有了一些这样的方法，荧光标记法是其中应用比较方便的一种。

4.2.5.1 探测钙调节和第二信使活动的荧光探剂

有几类探测钙调节和第二信使活动的荧光探剂:

1. 钙的相似物:三氯化铽(TbCl3 6H2O)和其它一些三价镧系元素是钙的荧光类似物，可以在很多重要的蛋白，如钙调素，肿瘤调节因子(oncomodulimn)，乳清蛋白(lactalbumin)和ATP酶等蛋白研究中用来研究金属和蛋白质的相互作用。铽和钙调素的I，II位点结合得最紧密，而Nd3+可以淬灭Tb3+的荧光，并可用于估计钙调素位点III和IV之间的距离。

2. 钙的拮抗剂:有些荧光探剂是钙的拮抗剂，如D-1579可阻断平滑肌和骨骼肌肌质网内Ca2+的外泄，也可阻断肌醇三磷酸酯引起的燕麦根和血小板囊泡液泡膜内钙离子的泄漏，抑制氯甲酰胆碱激发的大鼠胰腺腺泡内的淀粉酶的释放(这种抑制作用很可能是由于阻断了细胞钙的运动；D-1579还可以强烈地抑制由K+引起的肾上腺肾小球细胞内钙的增加。

3. 钙的荧光标记: 现有的各种钙荧光探针都是不发荧光的钙螯合剂BAPTA的衍生物，

4.2.5.2 钠和钾的荧光标记

4.2.6 荧光探剂作为pH指示剂

由于有些荧光分子的荧光强度随溶液pH值有明显变化，因此可以利用这些荧光分子作为pH值的指示剂，尤其是那些只在较窄的pH范围内发光的荧光分子，更适合作为pH指示剂。

表 : 荧光pH指示剂举例（郭书P109表5－4）:

● 蛋白质折叠的热变性研究

温度可以对生物大分子的结构造成扰动，可以引起生物大分子不同结构之间的转化。生物大分子各种结构的平衡状态随温度的变化可以提供Gibbs自由能的各种参数如焓、熵、热容量等的相关信息。由于系统的焓是温度函数，因此对热焓的实验研究可以得到分配函数(partition function)，从而得到系统的一个完备的热力学描述。由于DSC可以提供这样的信息，它也提供了一种确定蛋白质折叠和去折叠转变的能力学和这些反应的热力学的可能技术。DSC可以直接测量溶液的热容，现在已经开发出有足够的灵敏度和精确度的可以测量稀蛋白质溶液的热容的仪器。热容本身包含了丰富的信息，与结构参数直接相关。

一般考虑

构象平衡的统计热力学表达

描述单体蛋白质构象平衡的最基本的量是分配函数Q，Q定义为某种蛋白质所有可能状态的统计权重的和：

(1)

这里exp(－Gi / RT)为统计权重或Boltzmann指数，GI为每个状态的Gibbs自由能，R为气体常数，T为绝对温度。由于所研究的系统用粒子的某个常数和某个平均能量表征，式(1)可以等同于经典的分配函数。每个状态的Gibbs自由能由下面的标准热力学关系表示：

(2a)

(2b)

这里Hi(TR)和Si(TR)分别为状态i在参考温度TR下的相对热焓和熵，Cp,i是该状态的相对热容量。方程2a是最普遍的方程，方程(2b)为经典的方程，其中假定状态之间的热容量之差是与温度无关的。为方便起见，选择自然状态(状态0)为参照状态，用于表示相对热力学参数。

所有热力学参数可以用分配函数来表示。平均系统自由能（G）等于

G ＝ －RT lnQ (3)

平均剩余焓H等于

H ＝ RT2（ln Q /T） (4)

平均剩余熵S等于

S = RT（ln Q /T）+ R ln Q (5)

系统自由能随温度的变化用来定义相变的特征。

平均系统性质

我们观测到的宏观物理性质包含了系统中所有分子的贡献，因此，如果按分子平均或按克分子(摩尔)平均进行归一化，则得到的是规范的集合的平均。除非特别说明，下面的讨论都是以摩尔平均为基础。例如，如果我们指定系统的某个物理量为，则全部的和Total如下：

Total＝ (6)

ni为处于状态i的分子的数目，i为状态i对观测量Total的贡献。观测量的摩尔平均值()由Total除以系统中分子的总摩尔数：

＝ (7a)

(7b)

这里Pi是处于状态i的分子数， 表示对整个集合的平均，以区别于对时间的平均。但对各态历经的系统来说，这两种平均是等价的。对一个规范集合来说，Pi等于这个状态的统计权重与所有状态统计权重的和之比：

Pi= (8a)

Pi=exp(－ΔGi/RT)/Q （8b）

由此可以推出，整个集合的平均值等于

＝ (9)

方程(7)和(9)推出了一个系统某个任意的物理量与控制构象平衡的热力学参数之间的严格数学关系。除了热力学参数和它们的相关变量以外，一般来说i和Gi之间没有什么关系。例如，如果这个参量是一个波谱学观测量，例如荧光量子产率或荧光偏振度，或者是园二色实验中的椭圆度，显然这些参量与自由能没有任何可以预测的关系。因此，公式(7)和(9)只有在最简单的情况下，即某个平衡只涉及两个状态时，才能精确求解。但是，如果这个可观测量是热焓，而且从DSC实验中得知是随温度变化的，则情况将有所不同。

两态平衡

对于只有两种状态的平衡的情况，方程(7)变成

＝P00+PNN (10)

由于Pi＝1，

＝P00+PNN＝(1－PN) 0+PNN＝0－PN 0+ PNN＝0+PN(N－0)

PN＝(－0)/ (N－0) (11)

式(11)建立了可观测量与系统的热力学参数之间的直接联系，因为在这种情况下，

exp(－GN / RT )＝PN/ (1－PN) (12)

对于反应， 式(12)等于平衡常数KN。对于两态平衡，式(11)得到的分布等于处于状态N的真实分子数目，因此得出的热力学参数也与正确的值相对应。但如果这个平衡涉及两个以上的状态，则上述结论不成立。在大多数情况下，虽然事先并不知道系统是否符合两态机制，仍用方程(11)和(12)进行热变性曲线的分析。因此，由这些方程得到的热力学参数常称为“视在”参数。此外，对于两态平衡，由式(11)和(12)得到的值与用来测量平衡的观测量的本质无关，即不同的观测量将给出同样的结果。Lumry及其合作者多年前就认识到这一事实，他们设计了一系列实验来检验许多情况下两态近似是否成立。

Van’t Hoff 分析和协同度

如果在不同温度下测量一个可观测物理量的值，对一个两态转变来说，就有可能确定PN和KN。通常，在蛋白质折叠/去折叠研究中所遇到的情况下，处于天然状态下的分子数量I0在低温下最大，而在高温下处于变性状态下的分子数量最大。随着温度的提高，处于变性态的分子数量呈S形曲线增加(图1)。天然状态和变性状态分子数量相同的温度称为转变(相变)温度(Tm)。这个温度下GN＝0而KN＝1。相变时的热力学参数可以从KN随温度的变化得到：

lnKN＝(－HN/RT)+ SN/R (13)

因此，由lnKN随1/T和(－HN/R)的变化曲线的斜率，可以得到反应热焓的变化。方程(13)用来进行经典范得华分析，因此，这样得到的热焓称为范得华焓。由SN＝HN/Tm，可以求得Tm处的熵。

必须懂得：从范得华分析得到的热力学参数最终取决于计算得到的分子状态分布是否真实。如果该相变符合两态模型，则用方程(11)和(12)计算得到的分子状态分布符合真实分布，范得华热力学参数或“视在”参数是正确的。反之，则有关分布的计算和范得华热力学参数或“视在”参数也不正确的。问题在于：多数实验的情况下平衡状态的数量分布是未知的。蛋白质研究人员很早就认识到这种情况，他们的结论是：判断两态近似是否成立的最好方法是将从范得华分析得到的热焓变化与直接从量热仪测定的热焓变化进行比较。

量热仪测得的热焓是真实的转变热焓，因为它等于样品所释放或吸收的热量除以浓度。因此它是真实的状态函数，它仅与初始和终结状态的本质有关。而范得华热焓反映的是1摩尔“协同单位”转变时的热焓，这些协同单位的物理或结构内涵是系统的某个内在性质，与研究时采用的归一化无关。事实上它取决于系统内部协同作用的大小和范围。如果这些协同相互作用扩展到整个蛋白质分子，则范得华热焓和量热仪热焓相等；如果范得华热焓小于量热仪测得的热焓，则由系统界定的协同单位小于由研究者在计算热分析热焓时所定义的协同单位(通常为一摩尔蛋白质分子)。在这种情况下，相变只是通过部分折叠的中间体进行，因为内在协同单位小于蛋白质本身。反之，如果范得华热焓大于量热仪热焓，则意味着系统协同单位的扩展超出了单个分子的范围，存在着分子间的相互作用(通常是寡聚化)。因此，范得华热焓与量热仪热焓之比反映了系统内部的协同相互作用。

一般来说，范得华分析仅能正确地提供两态平衡的热力学参数。DSC一类的量热技术直接测量构象平衡的热力学参数，不附带任何模型假设，因此是直接获取系统能力学信息的唯一方法。此外，DSC也提供了一种研究相变热力学机制的途径。

差示扫描量热

DSC把量热仪样品池中的溶液的热容量作为温度的连续函数进行测量。为了确定蛋白质的热容量，需要蛋白质溶液和缓冲液扫描的数据。对于缓冲液(溶剂)的扫描，所量测的热容量可以写成

Cp,b＝ (14)

这里mb是样品池中溶剂的质量， 是缓冲液的比热容。类似地，蛋白质溶液的热容可以写为：

Cp,p＝ (15)

这里是单位质量蛋白质的热容量，mp是量热池中蛋白质的质量， 是溶剂的质量。 可以由下式得到：

(16)

这里，()等于被蛋白质取代的溶剂的质量，可以用蛋白质的偏比体积表示，这样就可以得到：

(17)

这里和分别为蛋白质和溶剂的偏比体积。偏摩尔比热容函数(Cp)可以简单地用与蛋白质的分子重量的乘积来表示。Cp是DSC测量的主要量，是我们讨论的中心。

偏摩尔热容量

市售DSC仪器(例如MicroCal，Hart，Seiko，Perkin-Elmer)不具备精确测量稀蛋白质溶液的偏摩尔比热容量所需要的灵敏度和基线稳定性。因此，用这些仪器进行的大多数蛋白质量热分析工作限制在与热变性或其它热致相变相关的变态的相对测量上。这里比较突出的是基线的差减，它会引起大量的任意性。这些年中，设计了不同的基线差减方法，但是这些方法多数是仪器缺陷的产物，而不是分析在方法论方面的突破。从理论上说，分析与相变有关的热容量相关的热容量函数的唯一要求是已知参考状态(一般是天然状态)的热容量。如果一种DSC仪器可以准确且可重复地测量蛋白质样品的偏摩尔热容量，则基线差减的任意性可以消除。这种水平的灵敏度和稳定性只是到最近才能达到，它为数据分析的新方法敞开了大门。

热容量差额函数

如果一种蛋白质发生相变，其热容量函数将在某些特征温度下出现异常(一个或多个峰)。在这种条件下，热容量函数已经不可能再归结为单一的结构状态，因为它包含了相变时出现的所有状态的贡献以及相变温度区热焓波动的加剧的影响。这些因素引起了特征峰或与热致相变相关的峰。蛋白质热致去折叠的热力学分析中最重要的量是热容量差额函数(Cp)，它等于量测得到的热容量函数减掉天然状态的热容量。

Cp＝Cp－Cp,0 (18)

图2解释了由实验数据估算Cp的步骤。如图2所示，如果天然状态的热容量已知，则即使在所采用的实验条件下天然状态从未被充分占据，也总是可以把天然状态的热容量从测量得到的热容量函数中减去。

热容量差额函数的统计热力学定义

在分析DSC数据时，需要从理论上采用统计热力学方法定义的最重要的量是平均差额热焓函数(H)，因为Cp等于H在常压下对温度的导数。平均差额热焓增量函数是相变过程中出现的所有分子状态的热焓贡献

H ＝ (19)

这里Pi表示第i种能态的分布数，或概率，Hi表示第i种能态的热焓与作为参照能态的天然能态的热焓之比。不同的相变模型中用不同的参数来表示Pi。热容量增量函数变为：

(20a)

(20b)

式右边相变热容量增量函数的第一项(Cp,tr)定义了热容量函数中的特征转变峰。式右边相变热容量增量函数的第一项(Cp,bl)定义了”S形”基线位移，这个位移通常是与蛋白质的去折叠或以Cp正变化为特征的其它相变相联系的。

相变差额热容量测量的是与构象转变相关的热焓的变动。对式(20a)直接微分得到：

(21a)

(21b)

必须认识到：方程(21b)是热焓分布的二阶矩或离差。因此，在相变区观察到的峰是蛋白质经历不同热焓状态之间的相互转变时热焓变化加剧的直接反映。

信息内涵

DSC提供三种信息：(1)绝对热容量；(2)总体热力学参数；(3)在相变中出现的能态被占据的概率和热力学参数即统计热力学信息。

绝对热容量

如上所述，绝对热容量的测量只有有限的几个具备适当的实验设备的实验室才能进行。绝对热容量可以用来得到与结构相关的信息，以及多肽链的水化程度，或在溶剂中的暴露程度。这个信息非常重要，可以用来估计热变性引起的去折叠的程度。已经证明：从高分辨率的结构参数可以精确预测不同蛋白质构象的绝对热容量。这些发现使得有可能发展解决蛋白质折叠能力学问题的新方法，还可以发展更精确的基于结构的分子设计方法。

总体热力学参数

与蛋白质热变性相关的最重要的总体热力学参数是去折叠态与天然态之间的自由能、热焓、熵和热容量的变化量(G)、(H)、(S)和(Cp)。 所有这些参数都是状态函数，即所有这些值只与变性态或天然态的本质有关，而与特定的转变途径或部分折叠中间态的存在无关。从实际的观点来看，这些参数与所测得的热容量函数的形状无关，可以用一种与模型无关的方式来确定。

热容量变化是热变性态与天然态热容量的差。热焓变化是相变热容量差额函数(Cp,tr)下的面积

H= (22)

这里的积分限为相变的起始和终止温度，所有分子基本上都处于初始态或最终态的温度。熵的变化量可以用下式来估计

S＝ (23)

H和S都是指的相变温度Tm下的值，即H＝H(Tm)，S=S(Tm)。必须注意：方程(22)和(23)都是根据相变差额热容量曲线定义的，这就意味着必须把Cp,bl从热容量差额函数中减去。多年来，采用了不同的差减方法。过去，Cp,bl通常用一个阶跃函数来近似，阶跃函数限定于中心位于Tm的垂线与热容量函数外推的起始值和终值的交点之间。由于基线与去折叠的程度成比例，因此可以得到一种更准确的估算方法，即用热容量函数的normalized积分来定义其形状。这种替代方法用计算机数字数据比较容易实现，对于两态相变，数学上是精确的。一般来说，总体热力学参数H和S对用什么方法来差减不太敏感。但是，对于热容量函数的形状的统计热力学分析，情况又有所不同。

热容量函数的统计热力学分析

总体热力学参数是状态函数，因此它们只取决于热容量函数的面积，而与其形状无关。另一方面，热容量函数的形状定义为热相变的途径或轨迹。因此从对于热容量函数形状的分析可以对相变过程中各能态的分布概率进行估价。

上面已经指出，热焓差额函数在DSC数据的统计热力学分析中起核心作用，它给出了实验与折叠/去折叠分配函数之间的直接联系。

从DSC数据可以直接得到H，因为它是Cp的积分。

H＝ (24)

这里T0是蛋白质处于天然态时的某个温度。

从方程(4)也可以得到H与分配函数之间的关系：

H＝RT2（lnQ/T）

Freire和Biltonen首先理解了这一点，把方程(4)重新写成积分的形式，从DSC可以直接得到折叠/去折叠分配函数：

lnQ＝ (25a)

(25b)

方程(25a)和(25b)为热容量增量函数的去卷积理论奠定了严格的基础，因为它们建立了实验数据和统计热力学的最基本的函数之间的数学联系。热焓函数作为一个物理可观测量的唯一性可以通过把它和其它技术测量的其它可观测量进行比较来解释。而相对于天然态的热焓增量H这样的可观测量的情况则有所不同，它是温度反转(inverse temperature)的的共轭变量。此时，平均热焓也是由方程(9)给出：

H＝ (26)

主要的不同点是，与任何可观测量不同，Hi也在方程(26)的指数项内发生。DSC的这个唯一的性质造成了分析上的极大差别，使得开发旨在获得折叠、去折叠转变的完全热力学表征的严格去卷积算法成为可能。对于其它物理可观测量来说，αi的值数学上与Pi值并不相关，也就是说，熔融曲线的幅度与热力学函数无关，实验数据不能用于获取相变的完全热力学描述。

对于热容量函数进行去卷积分析的主要目的是确定热致去折叠时被占据的那些能态的数量以及其中每一个状态的热力学参数。经过若干年时间，去卷积算法得到逐步完善。现在，最有效的去卷积算法中包括一种递归算法，这个算法包括多重循环，某个独立的循环都有一个非线性最小平方寻优的步骤，最后终止于一个全局非线性最小平方优化计算。应用这些方法分析了分子伴侣DnaK, α－乳白蛋白，葡萄状球菌核酸酶等的多态相变。

对实验确定的蛋白质热容量的分析

对蛋白质热容量的不同贡献

蛋白质的热容量起源于相应于内部振动、受阻转动及与溶剂的相互作用的热焓波动。整个相变区域有一个与方程(21)描述的相变相连的增强的热焓波动给出的附加的贡献。蛋白质水溶液中摩尔偏热容可以认为是由一个内在项和水化项组成。内在项包括来自共价键和非共价相互作用的贡献。这样,蛋白质的热容量可以写成:

(27)

第一项Cp,a 称为primary热容量,它包含了原子键和共价键的贡献.按照定义,这一项只取决于蛋白质的氨基酸组成,与蛋白质的构象状态无关.对于大量有机分子的实验研究表明:这些化合物的热容量在键或基团的水平上大部分是可加的。第二项Cp,b包含了蛋白质内所有非共价相互作用。第三项Cp,c包含了蛋白质与溶剂的相互作用即水化的贡献。Cp,b和Cp,c分别取决于蛋白质的物理状态、二级结构的组成含量和与溶剂的相互作用。

与折叠、去折叠或构象变化相关的热容量变化仅涉及Cp,b和Cp,c，因为这些蛋白质的转变不涉及质量或一级结构的变化

(28)

蛋白质的原初热容量

在生物学感兴趣的温度范围内(0100C)，蛋白质的原初热容量主要包括了每个价键的伸缩和弯折模式的振动频率及内部转动的贡献。在这个温度范围内，电子能级的贡献可以忽略不计。蛋白质的原初热容量可以从氨基酸单独的贡献、肽键的贡献及原子或键的可加性参数比较精确的计算出来。脱水状态下全部20种氨基酸的热容量已经测量得到。此外，单独的原子和化学键的贡献也通过分析一些小的有机化合物的热容量得到。表1和图4总结了25C下计算得到的10种球蛋白的原初热容量。

由单独的氨基酸的贡献计算得到的原初热容量接近测量得到的脱水蛋白质的热容量，这和蛋白质绝对热容量来源于共价键结构的想法是一致的。但是必须注意：由脱水天然蛋白质测量得到得的热容量的实验值一般比计算得到的原初热容量稍大一些，提示非共价相互作用也确实对热容量稍有贡献。对于脱水状态的蛋白质热容量测量的结果，其平均值为0.2980.003 cal/kg，而由氨基酸的热容量之和计算得到的平均原初热容量为0.2830.006 cal/kg。一般来说，按重量来计算，一级结构对脱水蛋白质热容量的贡献是类似的，大约占整个热容量的97％。

非共价相互作用对蛋白质热容量的贡献

如表1和图4所示，由氨基酸计算得到的热容量与脱水天然蛋白质的测量值相差很小，提示非共价相互作用的贡献也很小。如果把脱水热容量和原初热容量的差作为非共价结构贡献大小的标志，则非共价相互作用对热容量的贡献大约为0.007 cal/kg。预计非共价相互作用是蛋白质内堆积密度的函数，可以用埋藏在蛋白质内部的总面积来表示。

溶液中天然蛋白质的热容量

表1和图4中的蛋白质之所以被选择来进行计算，是因为它们在溶液中的热容量已经用量热方法得到。天然蛋白质的热容量大于脱水蛋白质的热容量，表明了水化对热容量的贡献。25C时水化对热容量的贡献大约是0.06 cal/kg，大约为天然状态下总热容量的15％。但是水化对不同蛋白质的相对贡献是不同的，提示蛋白质表面上的成分引起了热容量的增加。同样需要指出的是：25 C下溶液中天然蛋白质的热容量的温度依赖性也比脱水蛋白质大。

溶液中热容量的增加是由于蛋白质表面的原子与溶剂的相互作用。天然蛋白质暴露在溶剂中的表面包括了极性和非极性区域，其比例是不同的。平均来看，天然状态下55％的溶剂可及表面为非极性的，这定量地证明了水化对于热容量的贡献是正的。一般来说，蛋白质的水化热容量与非极性和极性溶剂可及表面的面积大小成正比，这与热容量随构象变化的情况是一致的。

溶液中天然状态蛋白质的热容量在可量测的温度范围内(大约050C)是温度的线性函数，其时间依赖性平均为1.6210-3 cal/k2g。但不同蛋白质差异明显，反映了暴露于溶剂的表面的组成不是均一的。

去折叠状态的热容量

25C时去折叠状态的热容量比天然状态要大。平均来说，去折叠状态比天然态的热容量大0.12cal/kmol，反映了天然状态下埋藏在内部不接触溶剂的极性和非极性残基的比例在去折叠态中暴露于溶剂后是不同的。虽然天然态的热容量与温度成线性关系，但去折叠态与温度的关系是非线性的。在0100C范围内去折叠状态的热容量与温度的关系可以用二阶多项式很好地近似

Cp=Cp(25)+a(T-25)+b(T-25)2 (29)

一般来说，天然态和去折叠态热容量大小及温度依赖性的不同主要反映了这些蛋白质构象下暴露于溶剂的极性和非极性表面比例的差别，此外也在一定程度是反映了折叠态内部非共价相互作用较小。下面将介绍：用一个数学函数就可以表示不同蛋白质构象的热容量的大小及其温度依赖性。

可质子化基团的热容量贡献

除了辅助因子、金属离子的存在等特殊影响以外，质子化效应可能是仅有的一个对蛋白质热容量有可量测到的贡献的一般性效应。具有可离子化基团的侧链如组氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸对于热容量的贡献是不同的。这取决于它们是否能质子化。质子基团对热容量的贡献Cp,p可表示如下：

Cp,p= (30)

其中，是该基团的质子化热容量，Fp是质子化的程度，Hp是有效质子化焓。第一项与质子化的程度成正比，第二项产生于质子化程度随温度的波动。一般来说，与整个热容量相比，质子化的贡献是较小的。例如，质子化的咪唑基比未质子化的咪唑基的热容量大4cal/kmol，质子化的羧基的热容量比未质子化的羧基大30cal/kmol。当Fp=0.5时，也就是pH值等于可质子化基团的pKa时，方程(30)中第二项的贡献得到最大值，例如，对于pH值等于pKa的非缓冲液中溶解的组氨酸，由于热波动引起的最大的对热容量的贡献约为70cal/k·mol，因为在此条件下ΔHp=-7kcal/mol