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纯化工作总结

时间：2022-11-15 16:10:21 下载该word文档

经过这四个月的试用期，通过在纯化过程中的不继学习和总结，对纯化有了一个大概的了解。
纯化主要分成三个步骤.。每个步骤对纯化结果的影响都非常大，三者密切联系。第一步首先是盐析。它是通过加入中性盐，中和分子表面的电荷，破坏其水化膜，使它的溶解度降低并沉淀析出。盐析是粗提纯阶段，通过盐析，可以使大部分蛋白沉淀出来。盐析对后面的操作影响很大，所以对盐析的选择要很注意。而影响盐析的主要因素是盐的饱和度，不同的蛋白，所需的饱和度不同，。当盐离子浓度较低时，主要是“盐溶”作用，盐浓度较高明时，才起盐析作用。蛋白的浓度对盐析的影响也很大。蛋白浓度越大时，越易沉淀，其他蛋白的共沉淀作用会降低分辨率。蛋白浓度控制在2%~3%为宜。我们是通过调节盐浓度，使混合蛋白溶液中的蛋白分段析出。通常我们采取两次盐析，第一次采取50%的饱和度，这一步可以使大多数蛋白沉淀下来，但是杂蛋白含量比较多，我们再通过40%，去除一部分杂蛋白，提高纯度。
在盐析中，我们需要注意的是，所配的饱和硫酸铵是否饱和，一般装饱和硫酸铵的容器底部应该有一层硫酸铵沉淀。再者是在调节浓度时，应先用生理盐水使蛋白充分溶解后才能加入饱和硫酸铵，否则蛋白就沉淀不下去。硫酸铵的饱和度一定要控制好，不然误差会很大，我们可以通过降低饱和硫酸铵浓度，去除更多杂蛋白，就像做RH008时，出来的样品颜色过深，我们就采取35%盐析的方法。虽然这可以提高纯度，但是饱和硫酸铵的浓度不能太低，极限值不能低于33%，否则我们需要的蛋白可能就沉淀不下来了。
第二步是透析。它的目的是脱盐。我们盐析后的蛋白溶液中盐离子离子浓度比较高，我们是将蛋白溶液装入透析袋中，在流水或缓冲液中进行透析，盐离子可能通过透析袋扩散到水或溶液中，而大分子的蛋白则不能通过透析袋。
透析前我们先用生理盐水将离心后的蛋白沉淀溶解到一定体积，大概浓度在20mg/ml。以缩小上样体积。透析对层析有一定的影响，如果透析不好，在层析时，在流洗过程中，蛋白盐离子浓度还很高的话，吸附不到柱子上，在走程序前就流窜出来，这样虽然第一次层析时回收率比较高，但杂蛋白也被洗下来了。
第一次层析前，先要用流水透析4个小时以上，否则除盐效果不好，透析袋不能装太满，要不然水分子跑不进去，起不到脱盐作用。二次层析的话流水透析时间不能太长,因为这样会可能会使蛋白变性。透析袋一般装样品的时候，不要超过长度的2/3。并且透析袋大小要适中，太大的话中间部分蛋白盐离子与水交换受到阻碍。太小的话又容易造成浪费。在流水透析时要不继更换水，并且翻转袋子，这样才能充分透析。像一些蛋白样液里还含有絮状的脂肪，可以用手捏一捏透析袋，要不然脂肪聚到一起，阻碍交换会影响效果。透析袋绑的时候要留有一小部分空间，并且挤掉里面的气泡。这样水分子才能进入，绑的时候捏一捏，看透析袋有没有破或是有气泡，如果有气泡的话，在透析过程中，透析袋会沉不下去，这样会影响到透析的效果。流水透析后再用流洗缓冲液透析，于4℃下透析过夜，可以起到平衡和缓冲的作用。
第三步是层析。我们用的是离子交换柱层析，通过改变溶液的PH和离子强度，使目的蛋白带上电荷，并具有较强的结合力，而其他杂质具有较弱的结合力，使目的分子结合到离子交换介质上，再通过改变洗脱液的离子强度和PH将结合在柱子上的蛋白洗脱下来的一个吸附解离过程。经过层析后，出来的样品基本上就很纯了。我们一般进行两次层析，但如果样品纯度要求不是很高的话，例如8号可以只进行一次层析，这样可以提高回收率。一般每次的回收率在40%左右。而如果纯度要求较高的话，我们在第二次层析时，根据分管收集的样品进行电泳图谱分析后，可分段合并。
影响层析结果的因素很多。与柱子的吸附能力有关，和上样的样品，上样量，原液的配制，洗脱时走的程序等很多因素有关。

所以我们要注意的是： 1．原液的配置一定要正确，在用盐酸调PH时，PH要在8.1左右，比目的蛋白的等电点高，才能使蛋白带负电，才能吸附到柱子上。在上样前，柱子要先流洗一段时间，这样才会使流动相具有一定的离子强度和一定的缓冲能力，，目的分子才能以一定的强度结合到离子交换柱上。并且还可以将结合不牢固的杂蛋白洗脱下来。
2．上样的量。一般1ml最大能吸附15mg蛋白，所以不能上样太多，柱子吸附不上去，造成浪费，上的太少的话走程序可能会因为拉得太长，出来的量很少。
3．
洗脱的程序。一般我们都固定用一个程序，但要根据上样的多少来设置，如果上样量太少的话，程序就要拉窄一些，否则拉太宽，出来的浓度和量都很小。还可以加快流速，便蛋白快些被洗下来。如果在走程序前就出现流窜峰，而且量很多的情况下，就不要走程序了，直接用50%B液洗脱，因些走程序的话会拉得很长，造成蛋白损失。
4．收集。之前我们对纯化还不是很清楚的情况下，都是根据AU值来收集的，慢慢才发现，还受很多因素影响，有时上样量不同，出来的峰形就不同，这时就不能根据AU值了，而是要根据峰形来看，前面一小段峰含有较多的杂蛋白，我们可以将中间的高峰分开收集，在过第一次层析时，后面的峰可以多收集一些，但是浓度如果在5mg/ml以下，基本就可以放弃了，有时还要结合电导率，电导率在12cm/ms以后，蛋白基本上已经出来了，这时我们也可以停止收集。但是这些都是在正常的情况收集,如果出现异常情况,像有时会出现几个峰,这时我们会把几个峰都收集起来，然后再做电泳，再从电泳的图谱分析,看哪个峰是我们需要的目的蛋白。

合并样品前我们要做一个电泳，根据第二次层析的样品，分管做电泳，再将纯度高的合并起来。

每次纯化不同的样品，我们都要重装柱子。装柱子的时候需要注意的是先用少量缓冲液浸泡填充料，装柱子的时候先在柱内保持一定高度的液体，防止产生气泡和分层。加入树脂借水的浮力让其慢慢下降，这样才不会造成装柱子装得太紧。

纯化看起来虽然很简单，但很多细节操作都要特别注意，否则都会产生很大误差，而且就算是同批原料，出来的结果都不一样，所以还得靠慢慢发现，善于总结，发现规律，不断完善。

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