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    蜕膜组织PD-1和PD-L1的表达及其与复发性流产的相关性

    时间：2023-01-19 03:23:18    下载该word文档
    第4华中科技大学学报(医学版8卷第3期第258页Vol.48　No.3　P.258　　　　　　　　年月20196ActaMedUnivSciTechnolHuazhonJun.　2019g蜕膜组织PD-1和PD-L1的表达及其与复发性流产的相关性∗周晓君,　丁锦丽,　杨　菁△武汉大学人民医院生殖医学中心,湖北省辅助生殖与胚胎发育医学临床研究中心,武汉430060(摘要:目的　探讨程序性细胞死亡蛋白1及其配体(在复发性流rorammedcelldeath-1,PD-1PD-liand1,PD-L1pgg,产(患者蜕膜组织中的表达及其与RM的相关性。方法　以复发流产患者(及recurrentmiscarriaeRMRM组,18例g因意外妊娠行人工流产的患者(对照组,为研究对象,利用免疫组织化学技术分析蜕膜组织中C总巨噬细胞15例D68(、((、表面标志巨噬细胞M及C巨噬细胞MiNOS1亚型表面标志D1632亚型表面标志PD-1和PD-L1的定位和表达水与P而CD-1、PD-L1的共定位情况。结果　RM组CD68和iNOS阳性细胞比例显著高于对照组,D163阳性细胞比例显+++但两组患者C细胞比例差异无统计学意义。结论　RM患者蜕膜CD68PD-1+细胞比例显著低于对照组,D68PD-L1平,并用q免疫荧光技术检测蜕膜组织中CRT-PCR法及Westernblot检测蜕膜组织中PD-1和PD-L1的表达水平,D68著低于对照组;两组患者P但RM组PD-1表达水平差异无统计学意义,D-L1的表达水平显著低于对照组;RM组组织存在巨噬细胞的极化异常,蜕膜组织中巨噬细胞P从而调节RM的发D-1表达的异常可能参与了巨噬细胞的极化,病过程。关键词:复发性流产;　PD-1;　PD-L1;　巨噬细胞:/中图分类号:R714.21　　DOI10.3870.issn.1672-0741.2019.03.002jExressionofPD-1andPD-L1inDecidualTissuesandtheRoleinRecurrentMiscarriaepgReroductiveMedicalCenter,RenminHositalouhanUniversitHubeiClinicResearchCenterforAssistedppfWy,ReroductiveTechnolondEmbronicDeveloment,Wuhan430060,Chinapgyayp/Abstract　Obective　TheaimofthisstudastoinvestiatetheinvolvementofPD-1PD-L1inthedecidualtissuesandywgj(,,,theroleinrecurrentmiscarriaeRM.Methods　ThelocationofCD68iNOSCD163PD-1andPD-L1inthedecidualtissuesgweredetectedbmmunohistochemistr.ThemRNAandproteinlevelsofPD-1andPD-L1wereanalzedbRT-PCRandyiyyyq+Westernblottin.TheexressionofPD-1andPD-L1onmacrohaewasobservedbimmunofluorescence.Results　CD68andgppgy+,iNOSmacrohaepoulationsindecidualtissuesofRMgroueresinificantlincreasedaccomaniedbeducedCD163aspgppwgypyr,comaredwithcontrolrou.ThemRNAandproteinlevelsofPD-L1inRMgroueredecreasedwhilethoseofPD-1werepgppw++notsinificantlhaned.DualimmunofluorescenceassandicatedthattheproortionofCD68PD-1wasdecreasedinRMgycgyip++,rouwhiletheproortionofCD68PD-L1wasnotsinificantlhaned.Conclusion　PD-1andPD-L1inthedecidualtis-gppgycgsuesmihtbeinvolvedinthepathoenesisofRMbeulatinhedifferenceandpolarizationofmacrohae.Butthesecificggyrggtpgpmechanismneedsfurtherstud.y;Keords　recurrentmiscarriae　prorammedcelldeath-1;　prorammedcelldeath-liand1;　macrohaeggggpgyw△,,ZhouXiaounDininliYaninjgJgJg[]胎儿1%~3%1。RM的病因主要包括解剖异常、染色体异常、感染及内分泌异常等,但仍有部分患者,是常　　复发性流产(recurrentmiscarriaeRMg见的妊娠并发症之一,其在育龄女性中的发病率为2]。在特定的节母胎免疫微环境中发挥重要的作用[刺激下,巨噬细胞可以分化为M1和M2两个亚型,其中M参与调1型巨噬细胞可以产生促炎性因子,节炎性反应,而M2型巨噬细胞主要参与组织重塑3]。既往研究证实,与修复的过程[在正常妊娠早期,[]-5。6等炎性因子来介导炎症反应4程序性细胞死亡蛋白1(rorammedcellpg病因不明。近年来,免疫学因素在RM中的作用受到了广泛关注,其中巨噬细胞的研究已取得较大突破。巨噬细胞在蜕膜细胞中约占2在调0%~30%,国家自然科学基金资助项目(No.81571513:周晓君,女,医学硕士,1981年生,E-mail38084956@q.comq△通讯作者,,:CorresondinuthorE-maildraninot-pgaygqg@hmail.com∗蜕膜巨噬细胞主要分化为M而在RM患者中,2型,、巨噬细胞倾向于分化为M通过产生I1型,L-1IL-β及其配体(在调death-1,PD-1PD-liand1,PD-L1g
    周晓君等.蜕膜组织PD-1和PD-L1的表达及其与复发性流产的相关性·259·节免疫反应的过程中起重要的作用,包括促进调节[]性T细胞的发育、抑制Th17细胞反应等6。PD-11.3　免疫荧光染色是一个细胞表面受体,属于CD28家族。PD-1可以参与调节细胞增殖、细胞因子产生及T细胞毒性的]7-8。既往研究证实,激活等过程[PD1和PD-L1可9-10],以参与调节巨噬细胞的极化过程[且RM患者[1]-12,存在P但关于母胎D-1和PD-L1的差异表达1。滴加胎牛血清室温封闭3,加入兔抗30min0min(人P美国或P美国抗D-1Abcam,D-L1(Abcam,体工作液,将切片与羊抗兔4℃孵育过夜。次日,,与鼠抗人C抗体4℃孵育过夜,D68(NovusUSA再与羊抗鼠C博士德生物,武汉3二抗(37℃孵育y将石蜡包埋的蜕膜组织作4μ并m厚度切片,界面PD-1和PD-L1的表达及其与巨噬细胞的关系,以及与RM的关系,尚未见相关报道。因此,本。博士德生物,武汉FITC工作液(37℃孵育30min而F核DC3染色为红色,ITC染色为绿色,NA染y研究拟通过检测RM患者与正常对照组蜕膜组织巨噬细胞分布及其PD-1和初D-1和PD-L1在RMPD中的作用-L1的表达情况,步探索P。　材料与方法.1　临床资料及标本收集选择于人民医院生2殖01医6年学3月至中心就2诊018年的复6月在武汉大学发性流产患者(RM组和因意外妊娠行人工流产的患者(对照组作为研究对象。其中所有患者均满足以下纳入标准RM组18例,对照组:①孕周为7~15例。9周;②生殖道解剖结构正常;③正常月经周期;3个月内未使用过免疫抑制剂。R④纳入研究前然流产。本研究通过武汉大学人民医院伦理委员会2次或2次以上的2M定义为与同一异性连续经历0周前的自审核批准,所有患者均签署知情同意书。将负压吸宫术中获取的组织迅速用无菌生理盐水冲洗,一部分组织放入4%甲醛溶液中固定,另一部分组织迅速放入液氮中冻存,以备后续使用。.2　免疫组织化学染色将石蜡包埋的蜕膜组织作常规脱蜡后,4μm厚度切片,经性过氧化物酶3%过氧化氢处理,再用断非特异性染色。处理后,分别加入以E515min,以封闭内源D%胎牛血清封闭下T抗A抗原修复液20m经微in波,以阻加热体:鼠抗人美国、兔抗人(iN、OS(Abcam,美国、C兔抗人D68(NCo、Dv1u6s3,人AbPcDa-mL1,美国(Abcam兔,美国抗人P工作液D-1(A,b3c7a℃m,孵育美国1h兔。抗经国BS冲洗后,滴加羊抗鼠/兔二抗(,37℃孵育30min。滴加DABPr显ot色ein液tec(hDa,k美o梯度乙醇脱水ytomation,丹麦,树胶封片显色,苏木精复染及氨水返蓝后。分别对两组患者蜕膜组,织进行CD68、iNOS、CD163、PD-1、PD-L1染色。显微镜下细胞计数,并计算阳性细胞占总细胞数的比例。色为蓝色。荧光显微镜拍照。利用免疫荧光双染技术对蜕膜组织中细胞进行分析,计数双阳性细胞CD68+PD-1+及,并计算双阳性细胞CD68+PD-L1+的占总细胞数的比例。1.4　qRT-PCR检测Trizol法提取组织总盒说明书(SYBRgreenTa染料KaR进a,行日P本CRR进NA扩行。增逆按。转照PD录逆-1反转基应录因,试上加剂下入游引物分别为:C5′-CCAGGATGGTTCTTAGA-GPTD-CLC1C-3基′和因上5′-下TT游TA引G物CA分CG别A为AG:5C′T-CTTGCGCCGAATTT-3T′-;TCATAGTATAGCGCATTT;-3′和5′-TGCAGCCAGGTC-G处理数据CAA-GGGCCTT。AGTTACTAAT-CT3′CTTTGGAAATGPGTDTGH基因上下游引物分别为:5′GGG-CC3T′。CA采TT用-32′和-ΔΔCt5′法-1.5　Westernblot检测利用蛋白,采用RIPA裂解液(碧云天,武汉提取组织总脂奶粉封闭0%分离胶和BCA试剂盒(碧云天检测蛋白浓度。配制1抗人30mi5n%浓缩胶,电泳及转膜后,,兔抗人PD-1(Abcam,美国5%低、兔美国P孵育过夜D-L1(Ab,c再与羊抗兔am,美国和/抗鼠二抗室温摇床孵鼠抗GAPDH(CST,育用1hIma。ge待充J软件进行半定量分析结果分洗涤后于凝胶成像系。统中扫描,利1.6　统计学方法用行数据分析及作图SPSS22.0和。计数资料以百分比表示GraphPadPrism6.0软件进,组间数据比较采用卡方检验;计量资料以均数(x■±s表示,组间均数比较采用t检验;以±标准差P<0.05为差异具有统计学意义。2　结果2.1　两组患者基线资料比较两组患者的年龄、孕周差异均无统计学意义,但RM组自然流产次数显著高于对照组(P<0.01,表1。111PC
    ·260·华中科技大学学报(医学版　　2019年6月第48卷第3期表1　两组患者的基线资料Table1　Characteristicofpatientsindifferentgrousp组别对照组RM组年龄(岁26.79±2.3827.02±3.50孕周(周7.98±0.808.03±1.02自然流产次数2.52±0.38∗0、(、表面标志iNOSM1表面标志CD163阳性细胞(染色,棕色信号定位于胞膜或胞质M2表面标志组,而C均P<D163阳性细胞率显著低于对照组(果显示,两组患者蜕膜组织均有C总巨噬细胞D68(2.2　两组患者蜕膜巨噬细胞数量比较∗　　与对照组比较,P<0.05(。进一步定量分析结果表明,图1ARM组CD68阳性细胞率及iNOS阳性细胞率均显著高于对照(。图10.05B利用免疫组织化学法对蜕膜组织进行染色,结∗;免疫组化染色检测CA:D68、iNOS和CD163表达(×400B:CD68、iNOS和CD163阳性细胞数分析,P<0.05Fi.1TheexressionofCD68,iNOSandCD163inthedecidualtissuesindifferentgrousppg图1　两组患者蜕膜组织CD68、iNOS和CD163的表达2.3　两组患者蜕膜中PD-1和PD-L1的表达情况的表达进行定位,结果表明,阳性染色主要出现于基。q质细胞中,胞膜或胞质着色(图2ART-PCR及Westernblot检测的结果显示,RM组与对照组之首先利用免疫组织化学染色对PD-1和PD-L1(但RM组的PD-L1的mRNA及蛋白水平[0.75±]均显著低于对照组(0.24vs.(1.03±0.11P<,见图20.05B、2C。(间PD-1的mRNA及蛋白水平[1.05±0.13vs.(],差异均无统计学意义(均P>00.97±0.21.05C:Westernblot检测PD-1、PD-L1蛋白表达水平∗;免疫组化染色检测PA:D-1、PD-L1在蜕膜组织中的表达及定位(×400B:PD-1、PD-L1的mRNA相对表达水平,P<0.05;Fi.2TheexressionofPD-1andPD-L1inthedecidualtissuesindifferentgrousppg图2　两组患者蜕膜组织PD-1、PD-L1的表达

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