过氧化氢酶米氏常数的测定

一、 实验目的

了解并掌握米氏常数的意义和测定方法

二、 实验原理

H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMnO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。

2H2O2 = 2H2O + O2

2KMnO4 + 5H2O2 + 3H2SO4 = 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 ↑ + 8H2O

本实验由马铃薯提供过氧化氢酶。在保持恒定的条件下，用相同浓度的过氧化氢酶催化不同浓度的H2O2分解。在一定限度内，酶促反应速度与H2O2浓度成正比。用双倒数作图法(即以1/v对1/[S]作图)可求得过氧化氢酶的Km值。

三、 实验器材

锥形瓶(6个) 吸管、酸式滴定管

四、 实验试剂

1、0.02mol/L 磷酸缓冲液(pH=7) 2、0.004 mol/L KMnO4(需标定)

3、0.05 mol/L H2O2(需标定) 4、25% H2SO4

五、实验操作

1、酶液的提取：称取马铃薯（去皮）5克，加0.02mol/L 磷酸缓冲液10mL，再加少量海砂，研磨成匀浆，离心(3000r/ min，10min)，上清液即为酶液。

2、滴定：取干燥锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：

先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。各瓶时间达5min时立即加2.0mL 25% H2SO4终止反应，充分混匀。用0.004 mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnO4体积。

六、实验计算

分别求出1─5瓶的底物浓度[S]和相应的反应速度v 。

C1V1

10

[S] =

5 ∕2C2V2

C1V1–

v =

式中 [S]：为底物物质的量浓度(mol/L)

C1：为H2O2物质的的量浓度(mol/L)

V1：为H2O2的体积(mL)

10：反应的总体积

v ：反应速度(mmol/min)

C2: KMnO4物质的量浓度(mol/L)

V2：KMnO4的体积(mL)

以1/ v对1/[S]作图求出Km。

七、实验注意事项

( 1 ) 按表先加H2O2及蒸馏水。

( 2 ) 准确控制各瓶中酶促反应时间尽量一致。

( 3 ) 各种试剂的加量应准确。